仇佳星，劉宇涵，郭泓江，張迪雅，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 藥理學系，北京 100005

成膠質細胞瘤(glioblastoma)是所有原發(fā)性惡性中樞神經系統(tǒng)腫瘤中常見的一種,具有高度的侵襲性和治療抵抗性,其5年生存率低于6.9%,中位生存期小于15個月[1]。成膠質細胞瘤患者預后不良的主要原因包括腫瘤內和腫瘤間細胞高度的異質性、腫瘤細胞的高侵襲和轉移能力以及術后極高的復發(fā)率,而這些特征也都可以通過腫瘤干細胞的假說進行合理的解釋,即腫瘤細胞的成瘤能力具有異質性,存在干細胞樣細胞(stem-like cells,SLCs)的亞群[2]。成膠質細胞瘤干細胞樣細胞(glioblastoma stem-like cells,GSCs)被認為能夠自我更新、增殖并且分化成其他腫瘤細胞類型,具有很強的可塑性以及對于放化療的抵抗性[3]。由于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用,對于GSCs的研究有助于開發(fā)更加有效的治療策略。

成膠質細胞瘤干細胞樣細胞研究的一個經典建模方法為神經球培養(yǎng)法(neuro-sphere formation assay),主要基于GSCs自我更新能力強,能夠在化學成分確定的無血清培養(yǎng)基中成球增殖,而分化程度較高的細胞在這樣的環(huán)境下不能自我更新,比例將逐漸降低[4-6]。此外,GSCs也可以通過在培養(yǎng)表面包被層黏連蛋白(laminin)或Matrigel基質膠實現(xiàn)貼壁培養(yǎng),讓細胞均勻地暴露在營養(yǎng)物質、氧氣、生長因子等GSCs增殖的關鍵因素之下,并且黏附的細胞比漂浮的球體也更適合于高通量測定和篩選的研究[7]。

然而,當前各個實驗室均使用了自己的培養(yǎng)方法來富集SLCs,包括了不同種類的培養(yǎng)基和添加劑[8]。這可能會導致實驗室之間的結果存在差異,可能是腫瘤干細胞理論受到質疑的原因之一[9-10]。因此,標準化SLCs的培養(yǎng)方法是必要的,以避免培養(yǎng)基成分引起的結果的偏差,促進不同實驗室結果的比較和交流。本研究提供了使用無血清干細胞培養(yǎng)基以及添加Matrigel基質膠包被的方式培養(yǎng)懸浮的和貼壁的成膠質細胞瘤U87干細胞樣細胞(U87 SLCs)的方法,并對兩種培養(yǎng)物的干性相關標志物的表達、代謝能力的改變和體內成瘤能力的變化進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人腦星形成膠質細胞瘤細胞系U87(國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫/中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.2 實驗動物:6周齡雄性SPF級BALB/c-nude小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.1.3 試劑:DMEM(高糖)培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、PBS(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心);胎牛血清、B-27添加劑、Accutase細胞消化液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、Hepes-Tris 4%～12%高分辨率預制膠、脫脂奶粉(翌圣生物科技股份有限公司);人EGF、bFGF蛋白(北京義翹神州科技股份有限公司);Matrigel基質膠(Corning公司);AG RNAex Pro RNA提取試劑、Evo M-MLV反轉錄試劑預混液、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司);RIPA裂解液、PMSF(北京索萊寶科技有限公司);β-actin抗體(Cell Signaling Technology);CD133、Nestin抗體(Proteintech公司);PE anti-human CD133抗體(BioLegend公司);細胞線粒體壓力測試試劑盒(Agilent公司)

1.2 方法

1.2.1 U87 SLCs的懸浮培養(yǎng):向DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基中添加B-27、20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF配成干細胞培養(yǎng)基。收集常規(guī)含血清DMEM培養(yǎng)基中的U87細胞,PBS洗細胞2遍后,以濃度1×104/mL細胞接種至干細胞培養(yǎng)基中。使用低黏附的培養(yǎng)表面,每2～3 d半數(shù)換液。

1.2.2 U87 SLCs的貼壁培養(yǎng):用DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel至不同的濃度,以50 μL/cm2的用量覆蓋培養(yǎng)表面,于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h以充分包被。用PBS清洗培養(yǎng)表面2次,再按濃度1×104/mL接種U87細胞。使用干細胞培養(yǎng)基,每2～3 d換液。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA表達:貼壁細胞棄去培養(yǎng)基、懸浮細胞離心收集沉淀后,加入AG RNAex Pro RNA提取試劑裂解細胞,再加入氯仿離心后收集含有總RNA的上清層,經異丙醇沉淀便可以回收得到細胞的總RNA?？俁NA定量后使用Evo M-MLV反轉錄試劑預混液進行cDNA合成,直接混合RNA模板、預混液和水進行反應。利用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒進行最終的PCR反應,混合待測基因的引物對、cDNA、預混試劑和水并按照試劑盒說明書內的溫度程序進行反應。采用2-ΔΔCt法計算目標基因的表達水平,內參基因選擇β-actin,引物序列如下(表1)。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列Table 1 Sequence of primers for RT-qPCR

1.2.4 Western blot檢測蛋白質水平:使用含PMSF的RIPA試劑裂解細胞提取蛋白質,以BCA法測定蛋白質濃度。添加上樣緩沖液并加熱10 min制備電泳樣品,每孔加30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE分離。分離后的蛋白質樣品濕式轉印至PVDF膜,再使用5 %脫脂奶粉封閉1 h。一抗1∶1 000稀釋,過夜孵育;二抗1∶5 000稀釋,室溫孵育1 h;洗滌液為TBST。最終膜在暗室內進行化學發(fā)光檢測。內參蛋白選擇β-actin。

1.2.5 流式細胞測量術檢測CD133+細胞比例:U87細胞或U87 SLCs用Accutase溶液消化為單細胞懸液,PBS洗細胞2遍后,將1×106的細胞重懸于100 μL PBS,再加入5 μL PE anti-human CD133抗體,于4 ℃避光孵育15 min。用流式細胞儀檢測CD133+細胞的比例,同時設置一個未染抗體的陰性對照。

1.2.6 Seahorse實時細胞代謝分析:將Matrigel 10倍稀釋后包被Seahorse細胞培養(yǎng)板,每孔接種8×104個U87細胞或U87 SLCs。檢測所用的呼吸作用調節(jié)劑的濃度為1.5 μmol/L寡霉素(oligomycin)、0.125 μmol/L羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙[carbonyl cyanide-4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone,FCCP]、0.5 μmol/L魚藤酮/抗霉素A(rotenone/antimycin A,Rot/AA)。檢測完成后,使用含PMSF的RIPA試劑提取每孔蛋白質,BCA法進行蛋白質定量,用蛋白質總量標化各孔的耗氧速率(oxygen consump-tion rate, OCR)。

1.2.7 裸鼠皮下移植瘤模型:U87細胞或懸浮培養(yǎng)的U87 SLCs用Accutase溶液消化為單細胞懸液,PBS洗細胞2遍后,調整密度重懸于PBS,皮下注射至裸鼠右側背部。U87細胞每只鼠注射1.5×106個,U87 SLCs每只鼠注射3×105個。40 d后,測量皮下腫瘤的長徑和短徑,并拍照記錄。腫瘤體積計算公式為“體積=1/2×長徑×短徑2”。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 懸浮培養(yǎng)的U87 SLCs的形態(tài)

使用干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)U87細胞5 d后,細胞呈現(xiàn)典型的細胞球形態(tài)(圖1A)。細胞球大小不一,包括部分增殖慢、尚未成球的單個細胞。繼續(xù)培養(yǎng)至15 d時,細胞球的體積明顯增大(圖1B)。較大的細胞球透光度降低,指示其中細胞更加致密。

圖1 U87干細胞樣細胞球的形態(tài)Fig 1 Morphology of U87 stem-like cell spheres

2.2 懸浮培養(yǎng)的U87 SLCs的干性標志物的鑒定

培養(yǎng)1周之后,干性標志物CD133、nestin和OLIG2的基因轉錄水平在懸浮培養(yǎng)的U87 SLCs中大幅升高,與U87細胞相比有極顯著的差異(P<0.001),而干性標志物CD44、FUT4/CD15和ITGA6的基因轉錄水平也有一定的提升(圖2A)。主要干性標志物CD133和nestin的蛋白質水平在懸浮培養(yǎng)的U87 SLCs中也表現(xiàn)出升高趨勢(圖2B)。培養(yǎng)1個月之后,CD133+細胞的比例從培養(yǎng)前的2.75 %升高至84.6 %(圖2C)。

A.mRNA levels of stemness markers; B.protein levels and quantitative results of stemness markers; C.proportion of CD133 positive cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with U87.圖2 U87干細胞樣細胞球具有更高的干性標志物的mRNA和蛋白質水平Fig 2 U87 stem-like cell spheres showed higher mRNA and protein levels of stemness markers n=4)

2.3 貼壁培養(yǎng)的U87 SLCs的形態(tài)

使用未稀釋的Matrigel包被培養(yǎng)表面后,誘導貼壁培養(yǎng)的U87 SLCs具有結團增殖的趨勢,團塊間細胞胞體拉長建立起網絡狀的連接(圖3A)。若以10倍稀釋的Matrigel包被,則U87 SLCs會均勻地平鋪貼壁增殖(圖3B)。包被培養(yǎng)表面的Matrigel濃度稀釋2倍及以上,所培養(yǎng)的U87 SLCs均為平鋪貼壁形態(tài),且經驗證的Matrigel發(fā)揮誘導貼壁作用的稀釋倍數(shù)最高為100倍(結果未展示)。

A.coated with undiluted Matrigel; B.coated with 10-fold diluted Matrigel.圖3 貼壁生長的U87干細胞樣細胞Fig 3 Adherent culture of U87 stem-like cells

2.4 貼壁培養(yǎng)的U87 SLCs的干性標志物的鑒定

使用10倍稀釋的Matrigel包被培養(yǎng)表面,主要干性標志物CD133和nestin的基因轉錄水平在貼壁的U87 SLCs中與U87相比大幅升高(P<0.001),干性標志物OLIG2、CD44、FUT4/CD15和ITGA6的轉錄水平也顯著提升(OLIG2和CD44:P<0.001;FUT4/CD15和ITGA6:P<0.01)(圖4A)。貼壁培養(yǎng)的U87 SLCs的主要干性標志物的蛋白質水平與懸浮培養(yǎng)表現(xiàn)出相似的升高趨勢(圖4B)。

A.mRNA levels of stemness markers; B.protein levels and quantitative results of stemness markers; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with U87.圖4 貼壁的U87干細胞樣細胞具有更高的干性標志物的mRNA和蛋白質水平Fig 4 Adherent U87 stem-like cells showed higher mRNA and protein levels of stemness markers n=4)

2.5 U87 SLCs具有更高的線粒體呼吸水平

與U87細胞相比,U87 SLCs在加入解偶聯(lián)劑FCCP后,誘導出更高的最大呼吸速率(maximal respiration rate),表明其更強的線粒體儲備呼吸能力(spare respiratory capacity),即U87 SLCs對增加的能量需求或壓力具有更強的反應能力(圖5)。

*P<0.05 compared with U87.圖5 U87干細胞樣細胞具有更高的耗氧速率Fig 5 U87 stem-like cells showed higher oxygen

2.6 U87 SLCs具有更強的體內成瘤能力

U87 SLCs接種動物體內40 d后,形成的腫瘤體積更大(圖6)。U87形成的腫瘤體積均值為667 mm3(n=6),U87 SLCs形成的腫瘤體積均值為1 246 mm3(n=6),為U87的1.87倍(P<0.05)。由于U87 SLCs的初始接種數(shù)目為U87的1/5,則U87 SLCs的成瘤能力近似估計為U87的9.34倍。

Representative 2 images from 6 samples, U87 SLCs on the left and U87 on the right (scale bar: 1 cm).圖6 U87細胞和U87干細胞樣細胞的皮下移植瘤Fig 6 Subcutaneous tumor of U87 cells and U87 stem-like cells

3 討論

越來越多的研究證實成膠質細胞瘤中存在一種具有干細胞特征的亞群,其處于緩慢分裂的狀態(tài),能夠產生一些增殖更快的祖細胞群以及非增殖的細胞,并能夠響應放化療的干預以及手術切除。然而,當前并沒有辦法分離或定義能夠絕對代表腫瘤干細胞的細胞圖譜,多數(shù)研究試圖通過鑒定可靠的標志物來分離或富集成膠質細胞瘤干細胞樣細胞。CD133被認為是多種正常組織和腫瘤類型中干細胞的標志物,廣泛用于分選具有干性特征的細胞群。Nestin是一種Ⅵ類中間絲蛋白,最初在發(fā)育過程中的神經干細胞中檢測到,現(xiàn)已被證明在多種惡性腫瘤中與其他干性標志物共表達[11]。CD133和nestin也成為鑒定GSCs最主要的兩個標志物。此外,CD44、CD15、整合素α6(integrin α6,ITGA6)以及少突膠質細胞譜系的主轉錄因子OLIG2等被報道在某些情況下可以用于富集腫瘤起始細胞,因此也可作為腫瘤細胞干性高低的一個檢驗標志[12]。

成膠質細胞瘤如同大多數(shù)腫瘤一樣,被描述為主要依賴糖酵解代謝,然而GSCs卻對線粒體氧化代謝更具偏好。GSCs通常比分化的腫瘤細胞糖酵解程度更低,但具有更高的線粒體儲備呼吸能力,同時保持更高的ATP水平[13]。這也對應了其更高的抗氧化應激的能力,與放化療的耐受密切相關。Seahorse實時細胞代謝分析是檢測細胞生物能量代謝的金標準,是一種基于培養(yǎng)板的檢測,需要細胞處于貼壁狀態(tài),因此實現(xiàn)GSCs貼壁對于某些應用是必要的。與層黏連蛋白10倍稀釋后作為貼壁劑相比,Matrigel提供了成分更加豐富的胞外基質和生長因子,并且在多種稀釋倍數(shù)下均能起誘導貼壁的作用。神經球培養(yǎng)法中細胞所形成的球體結構會帶來物理和幾何上的限制,阻止營養(yǎng)物質、生長因子等向內擴散,并且也缺乏體內微環(huán)境中基質細胞和分化的腫瘤細胞帶來的黏附和支持作用,因此神經球培養(yǎng)能否作為GSCs培養(yǎng)的最適宜的條件,也值得反思和改進[14]。

腫瘤干細胞的定義應基于一系列實際的細胞功能的標準,即自我更新的能力、連續(xù)移植時腫瘤起始的能力以及復現(xiàn)腫瘤內部異質性的能力[2]。因此,體內成瘤能力是腫瘤細胞干性特征的核心標準之一,干細胞樣細胞與分化細胞的主要差別即在于前者應具有更強的成瘤能力,在理想情況下,能夠單個細胞連續(xù)移植并成瘤。有效GSCs的富集,應該做到降低體內成瘤所需的最低接種細胞數(shù),提升同等接種細胞數(shù)的腫瘤生長速率和體積。

綜上所述,本研究培養(yǎng)兩種形態(tài)的GSCs,鑒定了與干性相關的細胞功能。作為具有更高干性的腫瘤細胞模型,U87 GSCs可用于后續(xù)腫瘤發(fā)生發(fā)展機理和藥物作用的研究。