肖 捷，黃繼賢，何立風(fēng)，李玉權(quán)，何 瑩，喻 亮?

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院體檢中心，廣東 韶關(guān) 512025；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512025 ；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 韶關(guān) 512025 ；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

慢性髓性白血?。–hronic Myeloid Leukemia，CML）是成年人群最常見的白血病之一，是嚴(yán)重依賴于單一基因變異的獲得性克隆性骨髓增殖性腫瘤[1-2]。持續(xù)性激活的酪氨酸激酶途徑導(dǎo)致突變的造血干細(xì)胞與正常的造血干細(xì)胞相比具有增殖優(yōu)勢，并逐漸取代正常造血干細(xì)胞[3]。酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosinekinase inhibitors，TKI）的應(yīng)用，已經(jīng)明顯改變了CML 的自然病程，顛覆了既往的傳統(tǒng)治療模式[4]。研究發(fā)現(xiàn)，充分合理使用TKI 治療的CML 患者，如能獲得良好的治療反應(yīng)，其預(yù)期壽命接近正常人群[5]。然而，20 余年來的臨床實踐證明，經(jīng)過第一代TKI伊馬替尼治療后有近40% 的CML 患者產(chǎn)生耐藥[6]，治療反應(yīng)差，導(dǎo)致疾病進(jìn)展，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳。甲磺酸氟馬替尼（flumatinib，F(xiàn)L）是我國近年來研發(fā)的、擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新一代TKI。相較于一代TKI 伊馬替尼，F(xiàn)L 的臨床試驗已經(jīng)證實其療效更好且安全性接近[7]。因此，本課題組在前期研究成功體外誘導(dǎo)FL 耐藥人CML 細(xì)胞株（K562-RF）的基礎(chǔ)上，對其耐藥機制進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)報告如下。

1 主要儀器和試劑

1.1 主要儀器

PowerPac Basic 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；電子分析天平（德國Sartorius 公司）；C170i 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Centrifuge 5430 R 和Centrifuge 5910 R 低 溫 離 心 機（德 國eppendorf 公 司）；MS 3 型 旋渦振蕩器和ROCKER 2D D 搖床（德國IKA 公司）；XB 100 型制冰機（寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司）；IX83 型熒光倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；ECLIPSE Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Multiskan Sky 酶標(biāo)儀和1300 A2 型生物安全柜（美國ThermoFisher 公司）；ALLIANCE Q9 MINI 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（英國UVITEC 公司）。

1.2 主要材料和試劑

K562 細(xì)胞株從中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫購得；FL 由江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；1640 培養(yǎng)基和特級胎牛血清均為美國Invitrogen公司的產(chǎn)品；phospho-EGFR（Tyr1092）免疫標(biāo)記抗體為碧云天公司的產(chǎn)品；多藥耐藥相關(guān)蛋白4（MRP4）單克隆抗體為Proteintech 公司的產(chǎn)品；GAPDH 兔一抗和二抗均為美國Cell Signaling Technology （CST）公司的產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 耐藥細(xì)胞株的建立、保存和復(fù)蘇 K562-RF 細(xì)胞由本課題組前期通過低濃度FL 與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)獲得，傳代時逐漸增加FL 的濃度，最終誘導(dǎo)出耐藥濃度為53 nmol/L 的K562-RF 細(xì)胞，置于液氮罐中長期保存。在Western blot 試驗前半個月，取出液氮凍存罐中的K562 和K562-RF 細(xì)胞，在水浴箱中復(fù)蘇后再次進(jìn)行培養(yǎng)、傳代和備用。

1.3.2 Western blot 試驗分析細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

1.3.2.1 提取蛋白質(zhì) 取二甲基亞砜（DMSO）和藥物處理后的K562 細(xì)胞與K562-RF 細(xì)胞，以RIPA 裂解液進(jìn)行冰浴裂解，離心后提取蛋白質(zhì)，通過BCA 法使用酶標(biāo)儀檢測蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白加入上樣緩沖液100 ℃金屬浴5 min 使蛋白變性后，立即置于冰浴中冷卻，并于半小時內(nèi)上樣。

1.3.2.2 電泳凝膠的制備 依據(jù)蛋白分子量的分離范圍制備不同濃度的SDS- 聚丙烯酰胺凝膠，灌膠后制備10% 濃縮膠，轉(zhuǎn)移至電泳槽上樣后進(jìn)行電泳。

1.3.2.3 Western blot 試驗 電泳完成后卸下凝膠板，切膠后將裁剪好的PVDF 膜蓋于凝膠上，蓋上轉(zhuǎn)膜板，置于轉(zhuǎn)膜槽漂洗后進(jìn)行一抗封閉，孵育過夜，完成后進(jìn)行二抗室溫孵育1 h，取出PVDF 膜，加ECL 顯色液后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，曝光時間依據(jù)蛋白發(fā)光的靈敏度設(shè)定，獲取顯影圖像后保存。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

研究中所得的數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism 9.3 軟件進(jìn)行作圖和分析，采用SPSS 18 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)差異的分析，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

Western blot 試驗結(jié)果顯示（圖1，A），經(jīng)氟馬替尼處理后，K562 細(xì)胞中人磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）（圖1，C），而K562-RF 細(xì)胞中p-EGFR 的表達(dá)水平雖有下降但沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖1，D）。研究結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)環(huán)境中，K562 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)較低，而K562-RF 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)水平與K562 細(xì)胞相比顯著增加（P＜0.01）（圖1，B），氟馬替尼處理后，K562 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），而K562-RF 細(xì)胞中MRP4 表達(dá)則明顯下降（P＜0.05）（圖1，D）。

圖1 K562 和K562-RF 細(xì)胞中p-EGFR 蛋白與MRP4 的表達(dá)

3 討論

CML 的耐藥機制包括BCR-ABL1 依賴性和非BCR-ABL1 依賴性兩種情況。CML 患者發(fā)生BCRABL1 激酶區(qū)突變?nèi)允悄壳耙阎@得性TKI 耐藥的主要機制。而關(guān)于BCR-ABL1 激酶區(qū)突變導(dǎo)致耐藥的原因尚不清楚[8]。TKI 的治療效果取決于藥物與其分子靶點的接近程度。在藥物靶向BCR-ABL1 的過程中，足夠的TKI 藥物濃度進(jìn)入CML 細(xì)胞內(nèi)部對于達(dá)到治療效果是至關(guān)重要的。藥物穿過細(xì)胞膜的運動主要由藥物轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)[9]。TKI 在細(xì)胞中流入和藥物流出之間的平衡對TKI 抑制BCR-ABL1 起到?jīng)Q定性的作用，這些轉(zhuǎn)運蛋白的變化可以解釋TKI 攝取無效和/ 或TKI 從細(xì)胞中過度排出引起的耐藥現(xiàn)象[10]。大多數(shù)藥物自由擴散穿過細(xì)胞膜的能力較低，因為它們的運動不依賴于ATP，而是由溶質(zhì)載體（SLC）轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)。ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)代謝物、化療藥物的轉(zhuǎn)運[11]。這些轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達(dá)可降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，影響其有效性[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，K562-RF 細(xì)胞在正常培養(yǎng)環(huán)境下MRP4 表達(dá)較未耐藥細(xì)胞K562 顯著增強，而氟馬替尼處理后K562-RF細(xì)胞的MRP4 表達(dá)明顯減弱，但K562 細(xì)胞的表達(dá)卻顯著增強，提示MRP4 與氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機制可能有關(guān)。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）發(fā)生磷酸化，繼而導(dǎo)致下游信號通路的激活，也可能與FL 耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機制有關(guān)。哺乳動物細(xì)胞的有絲分裂由多個蛋白激酶家族調(diào)控[13]，在復(fù)雜的調(diào)控中一些激酶的過度表達(dá)、激活或突變會導(dǎo)致細(xì)胞生長失控甚至轉(zhuǎn)化為腫瘤[14]。在比較K562 與K562-RF 細(xì)胞中不同信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平過程中，我們發(fā)現(xiàn)氟馬替尼處理后的K562 細(xì)胞p-EGFR 表達(dá)顯著下降，而K562-RF 細(xì)胞的p-EGFR 表達(dá)下降不明顯，提示p-EGFR 與氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機制可能有關(guān)。作為重要的生長因子受體酪氨酸激酶，EGFR 可以使細(xì)胞內(nèi)外部進(jìn)行通訊，從而決定有絲分裂的開始[15]。同時，EGFR 的激活也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的磷酸化。p-STAT3 能夠進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生長和存活。p-STAT3 的過度激活已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、耐藥和逃逸凋亡等現(xiàn)象相關(guān)。這些現(xiàn)象提示在FL 壓力下，細(xì)胞通過增強EGFR 的磷酸化水平來適應(yīng)并抵抗藥物的影響。這種耐藥性的產(chǎn)生可能與這些蛋白在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)K562-RF 細(xì)胞中的耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白MRP4 和p-EGFR 表達(dá)水平升高，與FL耐藥可能相關(guān)。雖然本研究對氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機制進(jìn)行了初步探討，但仍有許多工作需要完成才能闡明其耐藥機制。在下一步的研究中，我們將進(jìn)一步探討相關(guān)激酶信號通路的表達(dá)情況，探討和分析CML 耐藥的可能機制，探索CML 抗腫瘤治療的潛在新靶點。