胡 悅, 任保青, 陳陸琴, 曹建庭, 劉兵兵*

(1. 山西大學(xué)黃土高原研究所, 太原 030006; 2. 太原植物園, 太原 030021 )

麗豆(Calophacasinica) 是一種多年生直立灌木,為蟲(chóng)媒異花授粉型植物,隸屬于豆科蝶形花亞科麗豆屬 (CalophacaFisch. ex DC.)。該屬約10個(gè)種,有3個(gè)種分布在中國(guó),分別是麗豆 (C.sinica)、華麗豆 (C.chinensis) 和新疆麗豆 (C.soongorica) (李建平和陳思,2019)。其中,麗豆僅分布在內(nèi)蒙古陰山山脈以南和山西中南部地區(qū),目前其分布范圍仍在不斷縮小,其個(gè)體數(shù)量也在不斷變少(馬倩,2012),已成為華北地區(qū)特有的一種珍稀易危植物(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì),1993)。李建平和陳思(2019)研究表明,麗豆種子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖類(lèi)等人體不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),極具開(kāi)發(fā)潛力。此外,麗豆具有耐寒、耐旱、耐土壤貧瘠的特性,能在較為嚴(yán)峻的環(huán)境中生存且能為水土保持做出一定貢獻(xiàn)(武紅柱等,2017)。然而,我們對(duì)這樣一種兼具經(jīng)濟(jì)和生態(tài)雙重價(jià)值,且處于易危狀態(tài)的植物卻缺乏足夠的了解,尤其是利用代謝組學(xué)方法對(duì)其種子代謝組化學(xué)成分的解析鮮有報(bào)道。

植物代謝組學(xué)是一門(mén)新興的交叉學(xué)科(郭鳳丹等,2017),是系統(tǒng)生物學(xué)的主要分支之一(曾超珍等,2017)。它可對(duì)提取物中參與生物體新陳代謝且相對(duì)分子量不足1 000的內(nèi)源性小分子進(jìn)行無(wú)差別的整體性代謝成分分析(張傳義,2018)。代謝組學(xué)的研究方法經(jīng)歷了質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)(Verdonk et al.,2003)、高效液相色譜(high-performance liquid chromatog-raphy, HPLC)(林艷萍等,2007)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)等技術(shù),目前最新的方法是基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)的代謝組學(xué)技術(shù),此技術(shù)可以找到相似物種成分之間的變化趨勢(shì),從整體上研究其代謝產(chǎn)物的差異,目前已在植物學(xué)(段禮新和漆小泉,2015)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)(Tamas et al.,2011)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。比如,Rafael等(2019)通過(guò)LC-MS代謝組學(xué)方法分析了鷹嘴豆(Cicerarietinum)、扁豆(Lensculinaris)和白豆(Phaseolusvulgaris)之間的代謝物差異,結(jié)果從43種差異代謝物中鑒定到了3個(gè)種間的判別性化合物;Gong等(2020)通過(guò)比較代謝組學(xué)分析了3個(gè)水稻品種食用品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制,從而揭開(kāi)了3個(gè)品種間口感和風(fēng)味差異的核心因素;高淑芳等(2022)利用LC-MS技術(shù)表征了刀鱭卵巢內(nèi)400多種化學(xué)成分,并通過(guò)比較代謝組學(xué)方法鑒定出海水刀鱭和淡水刀鱭之間的47種差異代謝物,揭示了二者在卵巢發(fā)育上的分化;武紹龍等(2022)采用LC-MS技術(shù)鑒定出馬纓杜鵑在不同時(shí)期的973種代謝物,揭示了馬纓杜鵑花從開(kāi)花至凋謝過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化情況;姜武等(2021)對(duì)不同種質(zhì)多花黃精的化學(xué)成分進(jìn)行LC-MS檢測(cè),從紅桿和綠桿多花黃精樣品中共篩選出22種代謝產(chǎn)物,其中在紅桿多花黃精中表達(dá)量高于綠桿多花黃精的差異代謝物就有15種,此結(jié)果可為多花黃精優(yōu)良品種的選用提供一定的理論支持;Yuan等(2021)探究了西瓜野生種和栽培種間的差異代謝物,共鑒定出431種差異代謝物,為基于代謝組學(xué)的西瓜果實(shí)改良提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ),促進(jìn)了其營(yíng)養(yǎng)特性的增強(qiáng)或種質(zhì)的升級(jí)。由此可見(jiàn),基于LC-MS技術(shù)的代謝組研究為我們解析不同植物的代謝物差異和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較提供了一種高效的方法。

麗豆作為我國(guó)華北地區(qū)特有的一種珍稀野生植物資源(謝勇等,2018),亟須我們?nèi)媪私恹惗沟拇x組成分,以評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,從而為我們對(duì)麗豆資源的深度開(kāi)發(fā)和高效利用提供科學(xué)依據(jù)。大豆(Glycinemax)是麗豆的近緣種,它們同屬于豆科蝶形花亞科,也是人們?nèi)粘Ｖ参锏鞍鬃钪匾膩?lái)源之一(武林琳,2022),其所含有的多種生物活性成分對(duì)預(yù)防各種心腦血管疾病、糖尿病和癌癥起到一定的作用(Kumar et al., 2013)。因此,本研究選擇大豆為對(duì)照樣品,采用基于LC-MS技術(shù)的比較代謝組方法對(duì)麗豆和大豆的代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較,并通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)展代謝通路富集分析,解析其功能和作用,以期深入評(píng)估麗豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。本研究結(jié)果將為我們對(duì)麗豆資源的開(kāi)發(fā)利用,以及為將來(lái)全面揭示麗豆代謝組組成提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在本研究中,大豆是生活超市中最常見(jiàn)的黃大豆,而麗豆采自其原生境之一的山西省太原市天龍山自然保護(hù)區(qū)的山坡灌木叢中(112° 25′ 10.56″ E、37° 43′ 22.44″ N),海拔1 180 m。天龍山自然保護(hù)區(qū)地處黃土高原及華北平原交界抬升區(qū),海拔落差大,氣候分區(qū)豐富,屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候,受季風(fēng)影響,夏秋多雨并集中,冬春干旱多西北風(fēng),多年平均降水量為487 mm(郭艷萍和李洪建,2022),年內(nèi)降水分配不均,主要集中于7—9月;保護(hù)區(qū)內(nèi)植物資源較為豐富,植被覆蓋度高,且相對(duì)穩(wěn)定,具有典型的北溫帶性質(zhì)(郭秋霞, 2021)。按照生態(tài)學(xué)調(diào)查采樣方法我們采集了50株麗豆的種子(圖1),種子帶回實(shí)驗(yàn)室后,每株隨機(jī)選取3～5粒飽滿(mǎn)的種子制成1份混合樣品用于后續(xù)的代謝組分析。

圖1 麗豆植株(a)及種子(b)照片F(xiàn)ig. 1 Photos of plant (a) and seeds (b) of Calophaca sinica

1.2 代謝物提取

主要處理流程如下:(1)取大豆和麗豆種子各10 g(大約100粒),研磨儀充分打碎、研磨至粉狀待用;(2)在1.5 mL EP管中加入100 μL(約100 mg)步驟(1)中的樣本,再加入300 μL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo),渦旋混勻30 s;(3)冰水浴超聲10 min;(4)零下20 ℃ 靜置1 h;(5)在4 ℃,13 000 r·min-1條件下將樣本離心15 min;(6)小心取200 μL上清液加入2 mL進(jìn)樣瓶中,再取200 μL QC (quality control) 樣本上機(jī)檢測(cè)。

1.3 上機(jī)檢測(cè)

由沃特世Acquity I-Class PLUS超高效液相串聯(lián)沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜儀組成用于代謝組學(xué)分析的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),所使用色譜柱為購(gòu)自沃特世的Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm)。

正離子模式:流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。負(fù)離子模式:流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。進(jìn)樣體積為1 μL。

1.4 代謝物定量

對(duì)MassLynx V4.2采集的原始數(shù)據(jù)使用Progenesis QI軟件做峰提取、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理操作,基于Progenesis QI軟件在線METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)及北京百邁客生物科技有限公司自建庫(kù)進(jìn)行鑒定,同時(shí)進(jìn)行理論碎片識(shí)別。分析前先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,采取的方式是總峰面積歸一化即每個(gè)樣本的每個(gè)代謝物除以該樣本總的峰面積。

1.5 KEGG分析

將所有鑒定到的代謝物整理成*.txt文件,上傳至KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/kegg/)代謝物通路進(jìn)行注釋分析,在注釋結(jié)果中,選取KO pathway level2條目注釋最多的Top20注釋信息繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麗豆與大豆代謝組成分分析

麗豆和大豆中共檢測(cè)到1 857種代謝組成分,分屬于68個(gè)種類(lèi)(圖2)。其中,其他類(lèi)的化學(xué)成分最多,有1 271種;在剩余的586種代謝組成分中,種類(lèi)最多的前6位分別為羧酸及其衍生物(即氨基酸類(lèi))(135種)、脂肪?；?68種)、丙烯醇脂質(zhì)(43種)、有機(jī)氧化合物(40種)、類(lèi)固醇及其衍生物(34種)以及甘油磷脂(28種)。這一結(jié)果表明麗豆和大豆一樣,含有豐富多樣的氨基酸類(lèi)化合物,具有很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖2 麗豆與大豆代謝組成分類(lèi)別統(tǒng)計(jì)Fig. 2 Categorical statistics of metabolic components of Calophaca sinica and Glycine max

2.2 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

麗豆與大豆的差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中,其中P<0.1的代謝途徑有8條,分別是二萜類(lèi)生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,青霉素和頭孢菌素生物合成,肌醇磷酸代謝,糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成,生物合成自噬,賴(lài)氨酸生物合成,氨基酸的生物合成(圖3:a)。

a. 橫軸為注釋到該通路的差異代謝物數(shù)目,縱軸為通路名稱(chēng); b. 橫軸表示該通路中的差異代謝物與有通路注釋的所有差異代謝物的比值。1. 二萜類(lèi)生物合成; 2. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解; 3. 青霉素和頭孢菌素生物合成; 4. 肌醇磷酸鹽代謝; 5. 糖基磷脂酰肌醇(GPI)—錨; 6. 生物合成自噬—其他; 7. 賴(lài)氨酸生物合成; 8. 氨基酸的生物合成; 9. 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成; 10. 各種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成—第2部分; 11. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成; 12. 磷酸鹽和次磷酸鹽代謝; 13. 核黃素代謝; 14. 磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng); 15. 嘌呤代謝; 16. 甘油磷脂代謝; 17. 糖酵解/葡萄糖生成; 18. 吲哚生物堿生物合成; 19. 葡萄糖苷酸生物合成; 20. 花生四烯酸代謝。a. The horizontal axis is the number of differential metabolites annotated to the pathway, and the vertical axis is the name of the pathway; b. The horizontal axis represents the ratio of the differential metabolite in this pathway to all the differential metabolites with pathway annotation. 1. Diterpenoid biosynthesis; 2. Valine, leucine and isoleucine degradation; 3. Penicillin and cephalosporin biosynthesis; 4. Inositol phosphate metabolism; 5. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor; 6. Biosynthesis autophagy-other; 7. Lysine biosynthesis; 8. Biosynthesis of amino acids; 9. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; 10. Biosynthesis of various secondary metabolites-Part 2; 11. Valine, leucine and isoleucine biosynthesis; 12. Phosphonate and phosphinate metabolism; 13. Riboflavin metabolism; 14. Phosphatidylinositol signaling system; 15. Purine metabolism; 16. Glycerophospholipid metabolism; 17. Glycolysis/Gluconeogenesis; 18. Indole alkaloid biosynthesis; 19. Glucosinolate biosynthesis; 20. Arachidonic acid metabolism.圖3 差異代謝物通路分類(lèi)圖 (a)和KEGG富集圖 (b)Fig. 3 Differential metabolites pathway classification map (a) and KEGG enrichment map (b)

初級(jí)代謝產(chǎn)物富集量最多的通路是氨基酸的生物合成(圖3:b),分別為L(zhǎng)-纈氨酸↓、L-酵母氨酸↓、苯丙醇胺↓、高檸檬酸↓;賴(lài)氨酸生物合成,分別為L(zhǎng)-酵母氨酸↓和高檸檬酸↓;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,分別為奎尼酸↑和吡哌酸↓。次級(jí)代謝產(chǎn)物富集量最多的通路是各類(lèi)次生代謝生物合成,分別為羅漢松脂素↑和吡哌酸↓;嘌呤代謝,分別為吲哚-3-甲醛↑和鳥(niǎo)嘌呤核苷↓;甘油磷脂代謝,分別為磷脂酰肌醇↓和溶血磷脂酰膽堿[18∶3(6Z,9Z,12Z)]↓;花生四烯酸代謝,分別為Δ12-前列腺素J2↑和15-脫氧-Δ-12,14-前列腺素J2↓;二萜類(lèi)生物合成,分別為巴卡?、蟆蛯?duì)映-貝殼杉-16-烯-19-酸↓。綜上可見(jiàn),麗豆和大豆的初生代謝產(chǎn)物差異主要集中在各類(lèi)氨基酸的生物合成上,且整體表現(xiàn)為下調(diào);次生代謝產(chǎn)物的差異主要集中在羅漢松脂素,花生四烯酸以及二萜類(lèi)生物合成上,且主要表現(xiàn)為上調(diào)。

2.3 麗豆與大豆差異代謝物分析

通過(guò)對(duì)麗豆和大豆的代謝組成分的種類(lèi)和含量進(jìn)行兩兩比較,共檢測(cè)出159種差異代謝物(表1)。其中,大約30%(48種)的差異代謝物在麗豆中含量高于大豆,且有5種為麗豆中特有成分;剩余約70%(111種)的差異代謝物在麗豆中的含量低于大豆,且有4種在麗豆中未被檢出,是大豆的特有成分。由上述結(jié)果可見(jiàn),在代謝物成分的含量上,二者的差異不足10%,即麗豆中超過(guò)90%的代謝物在含量上與大豆相似,表明麗豆與大豆一樣,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;在差異代謝物成分的種類(lèi)(159種)組成上,麗豆雖然比大豆少4種,但是它比大豆多了5種獨(dú)有的成分,這表明與大豆相比,麗豆有其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 麗豆和大豆的差異代謝物Table 1 Differential metabolites of Calophaca sinica and Glycine max

在159種差異代謝物中,麗豆比大豆含量高的化學(xué)組分共有43種,其具體的相對(duì)含量詳見(jiàn)表2。由表2可知,僅有不到10種化學(xué)組分屬于初級(jí)代謝物,如屬于氨基酸類(lèi)代謝過(guò)程中的L-苯丙氨酸-L-脯氨酸和絲氨酸-組氨酸,糖類(lèi)代謝過(guò)程中的Gypsogenin 3-O-鼠李糖基葡糖醛酸,28- [葡糖基-(1->6)-葡糖基]齊墩果酸3-阿拉伯糖苷,以及β-檸檬酸等。其中,麗豆中L-苯丙氨酸-L-脯氨酸的含量遠(yuǎn)高于大豆,大約是大豆的40倍;麗豆中β-檸檬酸的含量是大豆的10倍。剩余超過(guò)75%的化學(xué)組分均為次生代謝物,比如,麗豆在脂肪酰基、苯及其取代衍生物以及其他類(lèi)化學(xué)組分中,有12種化學(xué)組分的含量超過(guò)大豆10倍之余,它們分別是△12-前列腺素J2、奎尼酸、阿莫曲坦、N-甲基酪胺、氨芐西林、乙磺酰亞胺、4-羥基苯甲酸甲酯、脫落酸、阿魏酸等。此外,與大豆相比,麗豆中還存在5種特有的化學(xué)組分,它們分別是3-胍基丙酸、巴卡?、?、羅漢松脂素、無(wú)效苷和脫乙酰乙烯多林,也都屬于次生代謝物。這一結(jié)果表明,麗豆比大豆含量高的化學(xué)組分主要集中在次生代謝物方面,而在初生代謝物中,僅L-苯丙氨酸-L-脯氨酸具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

3 討論與展望

代謝產(chǎn)物是生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生或消耗的有機(jī)化合物,它的組成種類(lèi)和含量決定著植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(李靜等,2017)。本研究對(duì)麗豆和大豆的比較代謝組研究結(jié)果表明,在二者中共檢測(cè)到1 857種代謝產(chǎn)物,而麗豆中超過(guò)90%的代謝產(chǎn)物與大豆不僅在成分上相似,含量上也相近,這一結(jié)果可能與二者是近緣種有關(guān),同時(shí)也表明麗豆與大豆一樣,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具備成為我們未來(lái)生活中植物蛋白第二來(lái)源的潛力。

在對(duì)二者的差異代謝物分析中,我們共檢測(cè)到159種化學(xué)組分,其中有48種(約30%)在麗豆中的含量高于大豆。KEGG注釋結(jié)果表明,這48種化學(xué)組分主要是一些次生代謝物,且大多集中在羅漢松脂素,花生四烯酸以及二萜類(lèi)生物合成上。比如,△12-前列腺素J2(△12-prostaglandin J2,△12-PGJ2),它在麗豆中的含量是大豆中的107倍,有研究表明利用△12-前列腺素J2形成的以聚乳酸-乙醇酸共聚物為載體的納米粒(△12-PGJ2-NC)可以使某些骨壞損區(qū)的基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào),可應(yīng)用于牙周病的治療,并且在骨壞損的修復(fù)方面具有很好的應(yīng)用潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值(Chen et al.,2015);奎尼酸在麗豆中的含量是大豆中的68倍,它可以抑制血小板的凝集,對(duì)腦血栓的形成具有一定抑制效應(yīng),在體內(nèi)還可以轉(zhuǎn)化為特殊物質(zhì),對(duì)病毒和癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,可用于抗病毒和抗癌藥物的制備,此外奎尼酸還具有抑制疼痛和減輕炎癥的效果(周萌,2013);阿莫曲坦在麗豆中的含量是大豆中的40倍,它是抗偏頭痛藥物中的有效成分,可用于治療常見(jiàn)的急性偏頭痛發(fā)作,且具有很高的血管選擇性,耐受性比較好,已被廣泛應(yīng)用(王鵬等,2016);N-甲基酪胺,在麗豆中的含量是大豆中的31倍,可用于治療休克(嚴(yán)幼芳等,1983; 戴漢云和熊正東,1989)。氨芐西林(ampicillin),別名氨芐青霉素,在麗豆中的含量是大豆中的13倍,它是一種可以抑制體內(nèi)致病菌的抗生素,通常用于治療多種細(xì)菌感染疾病如呼吸道、腸道細(xì)菌感染、腦膜炎以及感染性心內(nèi)膜炎等(楊茜等,2022)。乙磺酰亞胺又稱(chēng)乙琥胺,在麗豆中的含量是大豆中的12倍,可用于治療老年性耳聾(蘇毅鵬,2014)和兒童失神性癲癇(范磊和陳海燕,2013)。4-羥基苯甲酸甲酯和脫落酸,在麗豆中的含量是大豆中的11倍,前者能延緩與年齡相關(guān)的生理過(guò)程的衰退(Mi et al., 2018),后者可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖,還可以促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞的增大和定向造血干細(xì)胞的生長(zhǎng),是多種疾病治療的潛在藥物(郭天藝,2017)。阿魏酸在麗豆中的含量超過(guò)大豆10倍,有研究表明,阿魏酸可以抑制炎癥反應(yīng),達(dá)到治療動(dòng)脈粥樣硬化的目的(楊琳潔等,2021)。

除了上述化學(xué)組分外,本研究還發(fā)現(xiàn)了一些麗豆特有的化學(xué)組分。比如,β-胍基丙酸,它對(duì)于調(diào)節(jié)血糖水平、改善高血糖癥具有一定的療效,且β-胍基丙酸是一種可以溶于水的結(jié)晶粉末,因此糖尿病患者有時(shí)會(huì)將其加入食物中作為補(bǔ)充劑(Baumgarner et al.,2015)。巴卡?、笫躯惗怪械挠忠惶赜薪M分,它是紫杉酚的前體,它可以顯著促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫球蛋白,還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng),是一種理想的待開(kāi)發(fā)疫苗佐劑(袁林等,2014)。此外,還有羅漢松脂素,又稱(chēng)馬泰瑞松醇,它是一種較為常見(jiàn)的植物木酚素,具有抗腫瘤血管發(fā)生、減弱真菌活性、消除體內(nèi)自由基和抗癌作用(Xu et al., 2017)。

綜上所述,我們認(rèn)為麗豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與大豆相似,且其富含的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物在改善人體多種疾病方面有積極的作用。此外,本研究結(jié)果也表明麗豆種子的代謝產(chǎn)物種類(lèi)豐富,尤其有些對(duì)人體非常重要的次生代謝物,具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值,這些都為我們后期深入研究麗豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及科學(xué)地規(guī)劃人工栽培提供了參考和借鑒。