丁艷平 趙越 張晉平 馬佳樂(lè)

DOI：10.16783/j.cnki.nwnuz.2024.01.011

收稿日期：20230710;修改稿收到日期：20230928

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31760271）

作者簡(jiǎn)介：丁艷平（1980—），女，甘肅會(huì)寧人，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師.主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生理學(xué).

Email：dingyp05@163.com

摘要：親吻素（Kisspeptin）通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)動(dòng)物繁殖起重要的調(diào)控作用.為了探討親吻素在牦牛精子發(fā)生中的生理功能及其對(duì)高原環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，文中對(duì)比研究了牦牛和黃牛睪丸的組織學(xué)特征及其親吻素的表達(dá)情況.結(jié)果表明，與黃牛相比，牦牛的曲細(xì)精管不飽滿，除精原細(xì)胞外，牦牛初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、早期/晚期精子細(xì)胞以及精子的數(shù)量都顯著少于黃牛（P＜0.01）.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在牦牛的精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、早期精細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞中都可見(jiàn)Kisspeptin免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)，這與黃牛表達(dá)位置一致，但是牦牛睪丸中陽(yáng)性產(chǎn)物光密度值（IOD）卻顯著高于黃牛；牦牛睪丸組織中Kisspeptin蛋白的表達(dá)顯著高于黃牛（P＜0.01）.該結(jié)果暗示Kisspeptin可能作為負(fù)調(diào)控因子，參與維持牦牛精子發(fā)生和精子成熟過(guò)程中的正常組織結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境生理狀態(tài).

關(guān)鍵詞：牦牛；睪丸；親吻素；Kiss-1陽(yáng)性產(chǎn)物；精子發(fā)生

中圖分類號(hào)：S 826??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1001-988Ⅹ（2024）01-0070-06

Histology and kisspeptin expression in the

testis of the Tibetan Plateau yak

DING Yan-ping，ZHAO Yue，ZHANG Jin-ping，MA Jia-le

（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China）

Abstract：Kisspeptin plays an important role in animal reproduction through the hypothalamic-pituitary-gonadal axis.In order to investigate the physiological function of kisspeptin in yak spermatogenesis and its adaptation mechanism to plateau environment，the histological characteristics and expression of kisspeptin in testis of yak and cattle were compared.The results showed that compared with cattle，the number of primary spermatocyte，secondary spermatocyte，early/late spermatocyte and spermatocyte in yak are significantly lower than that in cattle（P＜0.01）.Immunohistochemical results showed that kisspeptin immunopositive products are expressed in spermatogonium，primary spermatocyte，secondary spermatocyte，early spermatocyte and stromal cell of yak，which are consistent with the expression position of cattle，but the IOD value of positive substances in testis of yak is significantly higher than that of cattle.The expression of kisspeptin protein in the testicular tissue of yaks is significantly higher than that of cattle（P<0.01）.The results showed that kisspeptin，as a negative regulator，is involved in maintaining the normal tissue structure and microenvironmental physiological state of yak spermatogenesis and sperm maturation.

Key words：yak；testis；kisspeptins；Kiss-1 positive product;spermatogenesis

親吻素（Kisspeptin）是由Kiss-1基因編碼的一組多肽，其在哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［1-2］.現(xiàn)在已經(jīng)清楚，Kiss-1主要由下丘腦神經(jīng)元分泌，通過(guò)刺激促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元細(xì)胞上同源的G蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)初情期生殖功能相關(guān)的下游基因.已有研究表明，大鼠和人被注射 Kiss-1基因的表達(dá)產(chǎn)物親吻素后，可以迅速促進(jìn)黃體生成素和睪酮水平的升高［3-4］.親吻素可以推動(dòng)青春期的啟動(dòng)，維持正常的生殖能力，而且Kiss-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官中均有表達(dá)，與生殖功能密切相關(guān).馮俊鵬等［5］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸中Kiss-1/GPR54的表達(dá)在生殖周期的不同階段表達(dá)存在時(shí)序性，表明其在大鼠生精細(xì)胞成熟的過(guò)程中起著一定的調(diào)節(jié)作用.劉紅羽等［6］發(fā)現(xiàn)Kiss-1也表達(dá)在山羊附睪中，說(shuō)明Kiss在精子發(fā)生和精子保存過(guò)程中可能起著重要作用.荀文娟等［7］發(fā)現(xiàn)，Kiss-1的陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)在五指山豬的睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞中；而在精子中，Kiss-1的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物卻未被發(fā)現(xiàn)，表示Kiss-1在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.上述研究表明，Kiss-1在雄性哺乳動(dòng)物的生殖與發(fā)育相關(guān)調(diào)控機(jī)制中具有重要作用.

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原地區(qū)特有的一種全年放牧動(dòng)物，對(duì)高原高寒、低氧、枯草期長(zhǎng)等惡劣條件有極高的適應(yīng)性.牦牛是一種季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，為了使繁殖成功率最大化，會(huì)選擇在氣候溫暖、牧草豐茂的暮夏或秋季（6月～10月）發(fā)情，但其繁殖性能較低［8］.與之生存環(huán)境不同，黃牛是一種全年發(fā)情的物種，而Kiss-1在牦牛和黃牛睪丸組織內(nèi)的表達(dá)是否有差異，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.

本研究以牦牛作為研究對(duì)象，通過(guò)與黃牛做對(duì)比，對(duì)其睪丸中的Kisspeptin進(jìn)行定性、定位和定量研究，以便探討Kiss-1在睪丸精子發(fā)生、雄激素合成和分泌中的生理作用，為研究Kiss-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)牦牛的季節(jié)性發(fā)情的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)資料.

1? 材料和方法

1.1? 組織采集與處理

牦牛組織樣品取自甘肅省天祝藏族自治縣屠宰場(chǎng)（海拔約3 500 m），黃牛組織樣品取自甘肅臨夏屠宰場(chǎng)（海拔約1 300 m）.所采樣本均為健康的4頭成年（3～4歲）公牛，平均體重為220 kg.牛被處死后立即取其睪丸組織，固定于40 g·L-1的多聚甲醛中，于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 ?免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（SP法）檢測(cè)睪丸中相關(guān)蛋白的表達(dá)［9］.經(jīng)固定的睪丸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片（片厚5 μm），使用梯度酒精對(duì)切片脫蠟，用檸檬酸鈉進(jìn)行熱修復(fù)，滴加 H2O2 溶液（3%）去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，再經(jīng)山羊血清封閉，滴加兔抗Kiss-1（1∶200，Boster）.在陰性對(duì)照組中，以PBS緩沖液代替一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，用免疫組化試劑盒依次進(jìn)行二抗 、三抗孵育，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺法（DAB法）顯色后，進(jìn)行復(fù)染和封片.

1.3? Western blot檢測(cè)

提取睪丸總蛋白，采用比辛基奎寧酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度.含等量蛋白（20 μg）的樣品在蛋白上樣緩沖液中煮沸3 min，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上.用5%脫脂牛奶在PBS中封閉1 h后，用抗Kiss-1多克隆抗體（1∶1000）在5% BSA中在4 ℃孵育過(guò)夜.次日，TPBS洗滌PVDF膜3次，每次10 min；二抗室溫?fù)u床孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，每次 10 min.增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）檢測(cè)液放射自顯影，用凝膠系統(tǒng)成像儀采集圖像.結(jié)果用 Image J 進(jìn)行條帶分析.

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在組織切片中隨機(jī)選擇5張，并在每個(gè)切片中隨機(jī)選擇10個(gè)區(qū)域在Olympus顯微鏡下拍照.牦牛和黃牛睪丸中各種類型細(xì)胞的鑒定依據(jù)文獻(xiàn)［10］進(jìn)行；免疫組織化學(xué)切片以胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕褐色顆粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞，分析間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)，每張切片在固定光亮度下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-Plus Pro 6.0軟件分析，計(jì)算出每張照片的IOD值.所有數(shù)據(jù)采用SPSS-17.0進(jìn)行t-檢驗(yàn)及單因素方差分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異，各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2? 結(jié)果

2.1? 牦牛睪丸組織結(jié)構(gòu)

牦牛睪丸有間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、血管以及結(jié)締組織等，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.從圖1可以看出，牦牛的睪丸組織要比黃牛更加松弛，并且曲細(xì)精管也不如黃牛的飽滿（圖1A，A1，B，B1）；精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的數(shù)量皆少于黃牛（P＜0.01），而牦牛精原細(xì)胞和支持細(xì)胞的數(shù)量與黃?；疽恢拢▓D2）.

2.2? Kiss-1陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物在睪丸組織中的表達(dá)

對(duì)牦牛和黃牛睪丸組織 Kiss-1的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行觀察（圖3），可見(jiàn)在牦牛睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)的精原細(xì)胞、初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞及精細(xì)胞（早期）中均有Kiss-1陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的表達(dá)，而在晚期精子細(xì)胞、精子以及支持細(xì)胞中無(wú)棕色陽(yáng)性產(chǎn)物；在睪丸間質(zhì)中，陽(yáng)性產(chǎn)物僅在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在間質(zhì)的血管和其他細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物.黃牛的表達(dá)位置特征與牦牛一致.對(duì)牦牛睪丸 Kiss-1陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均吸光度進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)IOD值從高到低順次為：初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精原細(xì)胞、精子細(xì)胞（早期）;黃牛的IOD值表達(dá)趨勢(shì)與牦牛一致，然而牦牛睪丸內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞IOD值顯著高于黃牛陽(yáng)性細(xì)胞相應(yīng)的IOD值.

2.3? 牦牛睪丸組織中 Kisspeptin 蛋白的表達(dá)

采用western blot分析Kisspeptin 蛋白在黃牛和牦牛睪丸組織中的表達(dá)狀況，并以NAPDH為內(nèi)參蛋白（圖5）.結(jié)果表明Kisspeptin 蛋白在牦牛和黃牛睪丸組織中均有表達(dá)，但在牦牛的睪丸組織中表達(dá)量極顯著高于黃牛組織（P<0.01）.

3? 討論

動(dòng)物的生殖過(guò)程需要耗費(fèi)能量，因此在機(jī)體能量不足或能量過(guò)剩時(shí)，都會(huì)通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）軸影響生殖功能，而Kiss-1神經(jīng)元作為生殖和能量平衡的連接節(jié)點(diǎn)，機(jī)體能量狀態(tài)的變化可能也會(huì)通過(guò)Kiss-1系統(tǒng)間接影響動(dòng)物生殖相關(guān)的行為［11］.本研究結(jié)果表明，除了精原細(xì)胞外，牦牛睪丸中生殖細(xì)胞和精子的數(shù)量均顯著少于黃牛睪丸中的相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量（P＜0.01），曲細(xì)精管也不如黃牛的飽滿，這可能與牦牛生存的高原環(huán)境營(yíng)養(yǎng)匱乏有關(guān).

精子的發(fā)生在雄性哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中體現(xiàn)出高度的協(xié)調(diào)性，其過(guò)程要經(jīng)過(guò)精原細(xì)胞的有絲分裂、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精細(xì)胞通過(guò)形態(tài)變化成為成熟精子三個(gè)階段［10］.Sethu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Kiss-1在生精細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，從精細(xì)胞成熟的整個(gè)過(guò)程來(lái)看，Kiss-1的表達(dá)呈逐漸下調(diào)趨勢(shì).Ramzan等［13］用1 μg的Kisspeptim-10處理大鼠后發(fā)現(xiàn)生精細(xì)胞的有絲分裂系數(shù)顯著增加，而減數(shù)分裂指數(shù)顯著減小，與之對(duì)應(yīng)的是A型精原細(xì)胞、早期精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞的數(shù)量都顯著降低.間質(zhì)細(xì)胞具有合成、分泌雄性激素、產(chǎn)生生長(zhǎng)因子及生物活性物質(zhì)的功能，起到局部調(diào)節(jié)精子成熟微環(huán)境的作用［10］.有研究證實(shí)Kisspeptin的過(guò)表達(dá)可以顯著抑制大鼠體內(nèi)雄性激素（如睪酮）的分泌和血漿中黃體生成素（LH）的含量，并進(jìn)一步抑制睪丸發(fā)育；其早期精子細(xì)胞數(shù)量和生殖細(xì)胞總數(shù)與支持細(xì)胞的比值均顯著下降，表明支持細(xì)胞的效率和總支持能力的比值降低，最終對(duì)性腺軸發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［14-15］.還有研究表明，Kiss-1對(duì)動(dòng)物睪酮的分泌調(diào)控作用強(qiáng)于芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1（BMAL1）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）以及瘦素（Leptin）等因子［16-21］.目前關(guān)于不同物種的睪丸中Kiss-1/GPR54表達(dá)定位研究結(jié)果存在一些爭(zhēng)議，例如王雪松等［22］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠的間質(zhì)細(xì)胞中并沒(méi)有表達(dá)Kiss-1陽(yáng)性產(chǎn)物，但是大部分研究支持生長(zhǎng)期大鼠的睪丸和間質(zhì)細(xì)胞中有Kiss-1的表達(dá)［5］，而且從出生到衰老各階段小鼠睪丸中Kiss-1 的表達(dá)定位呈周期性分布［23］.這說(shuō)明在生殖周期的不同階段Kiss-1/GPR54系統(tǒng)在睪丸中的生理功能可能有所不同.本實(shí)驗(yàn)中，在成年牦牛的睪丸組織中，Kiss-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在精原細(xì)胞、初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞以及早期精子細(xì)胞中均得到表達(dá)，而且在間質(zhì)細(xì)胞中也出現(xiàn)了Kiss-1陽(yáng)性產(chǎn)物，但是其Kiss-1陽(yáng)性IOD值在生精細(xì)胞的成熟過(guò)程中具有表達(dá)差異，而黃牛的陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)位置和IOD值與牦牛一致.但是值得注意的是，牦牛睪丸內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞IOD值顯著高于黃牛陽(yáng)性細(xì)胞相應(yīng)的IOD值，說(shuō)明Kiss-1作為一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子參與了牦牛生精細(xì)胞的調(diào)控，

也可以解釋牦牛的季節(jié)性發(fā)情和黃牛的常年發(fā)情的生理現(xiàn)象可能受到了體內(nèi)Kiss-1的表達(dá)調(diào)控.

綜上所述，Kiss-1在牦牛的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且Kisspeptin及其表達(dá)產(chǎn)物在牦牛睪丸組織中顯著提高，暗示Kiss-1作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，可能在精原細(xì)胞有絲分裂和精母細(xì)胞減數(shù)分裂中起著重要的調(diào)控作用，可能參與了牦牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄性激素的合成和分泌來(lái)維持精子成熟的微環(huán)境生理狀態(tài)以及正常組織結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)其特有的生存環(huán)境.

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（責(zé)任編輯? 陸泉芳）