刁靜茹 肖奇贊 張淋淋 閆利甜 趙保衛(wèi)

DOI：10.16783/j.cnki.nwnuz.2024.01.010

收稿日期：20230720;修改稿收到日期：20231008

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41261077）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2021B-102）

作者簡(jiǎn)介：刁靜茹（1977—），女，山東平原人，副教授，博士.主要研究方向?yàn)槲廴究刂苹瘜W(xué)及土壤修復(fù).

Email：diaojr@qq.com

摘要：研究可生物降解螯合劑N-十二?；叶啡宜猁}（LED3A）誘導(dǎo)強(qiáng)化紫花苜蓿修復(fù)Cd污染土壤的效果，采用盆栽方法，考察LED3A對(duì)紫花苜蓿生理指標(biāo)、Cd亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)以及增效提取土壤中Cd的影響.結(jié)果表明，Cd脅迫顯著抑制紫花苜蓿的生長(zhǎng)及光合作用，增加丙二醛（MDA）的積累.而在土培體系中施用 LED3A，可以提高植株生物量、光合色素含量、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損傷和Cd誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激.LED3A的螯合強(qiáng)化作用能夠增大紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)中Cd的分布比例，促使植株中的Cd由高活性形態(tài)向低活性形態(tài)轉(zhuǎn)化，通過(guò)細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)隔化提高耐Cd性能，進(jìn)而減輕毒害.與不添加LED3A組相比，最佳LED3A添加量（321.3 mg·kg-1）組紫花苜蓿植株中的總Cd含量和積累量分別提高了29.4%和69.1%，地下/地上富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別增加了28.6%，36.4%和10.5%.說(shuō)明添加適量LED3A可有效提高紫花苜蓿對(duì)Cd的耐受性與修復(fù)Cd污染土壤的效果.

關(guān)鍵詞：LED3A；紫花苜蓿；Cd污染土壤；植物修復(fù)；化學(xué)強(qiáng)化

中圖分類號(hào)：X 171.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1001-988Ⅹ（2024）01-0061-09

Effect of LED3A enhanced phytoremediation of

cadmium contaminated soil by alfalfa

DIAO Jing-ru，XIAO Qi-zan，ZHANG Lin-lin，YAN Li-tian，ZHAO Bao-wei

（School of Environmental and Municipal Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，Gansu，China）

Abstract：A biodegradable chelating agent named N-lauroyl ethylenediamine triacetate（LED3A） was applied to the induction-enhanced phytoremediation of Cd contaminated soil by alfalfa.The pot experiments were conducted to investigate the effect of LED3A on the physiological indexes of alfalfa，the variations in subcellular distribution and chemical forms of Cd in plants，as well as the performance of LED3A in assisting phytoextraction of Cd from soil.The results showed that Cd stress significantly inhibits the plant growth and photosynthesis，and increases malondialdehyde（MDA） accumulation.After application of LED3A into soil-cultivated system，the biomass，photosynthetic pigments content，peroxidase（POD） and superoxide dismutase（SOD） activities of alfalfa all increase.Changes in these indexes can alleviate cellular membrane lipid peroxidation damage and oxidative stress caused by Cd.LED3As chelating enhancement effect results in a higher proportion of Cd in the cytoplasm of alfalfa cells，facilitates the transformation of Cd from highly active forms to less active forms within the plant，improves Cd resistance and reduces toxicity through cell wall immobilization and vacuole compartmentalization.Compared with the treatment without LED3A，the total Cd content and accumulation in alfalfa at optimal LED3A dosage（321.3 mg·kg-1） are increased by 29.4% and 69.1%.The bioconcentration factor（BCF） and translocation factor（TF） of Cd in alfalfa root and shoot increase correspondingly by 28.6%，36.4% and 10.5%，respectively.In conclusion，the application of situable amount of LED3A can improve the Cd tolerance of alfalfa and enhance the efficiency of phytoremediation for Cd contaminated soil.

Key words：LED3A；alfalfa；Cd contaminated soil；phytoremediation；chemical enhancement

《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)土壤Cd污染危害嚴(yán)重，污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%，遠(yuǎn)高于其他重金屬污染物［1］.因此，Cd污染土壤的治理修復(fù)和農(nóng)業(yè)安全問(wèn)題備受關(guān)注.常見(jiàn)的重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)主要包括物理、化學(xué)、生物及其聯(lián)合修復(fù)方法，植物提取技術(shù)因具有成本低、環(huán)境擾動(dòng)少和可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的研究和發(fā)展［2］，選取合適的修復(fù)植物是該技術(shù)應(yīng)用的前提和關(guān)鍵.近年來(lái)，將高生物量經(jīng)濟(jì)植物作為修復(fù)主體受到眾多研究者的青睞［3］.豆科牧草紫花苜蓿（Medicago sativa L.）具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)草量高的特點(diǎn)，其發(fā)達(dá)的根系與根瘤菌的共生固氮作用能夠改善土壤物理性狀和養(yǎng)分狀況［4］.紫花苜蓿在重金屬污染土壤的植物修復(fù)方面表現(xiàn)出良好的潛力［5］，但是由于土壤中重金屬的生物有效性較低，植物根系吸收并向上遷移重金屬的能力有限，導(dǎo)致植物提取修復(fù)效率低下［6］.

螯合誘導(dǎo)植物修復(fù)技術(shù)是解決植物修復(fù)低效瓶頸的有效措施［7］，該技術(shù)是基于螯合劑對(duì)土壤中重金屬的活化作用，通過(guò)與重金屬形成穩(wěn)定可溶的螯合物提高其生物可利用性，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的提取修復(fù)效果［8］.如乙二胺四乙酸（EDTA）能夠?qū)⑼寥牢降闹亟饘衮辖馕镣寥酪合?，顯著提高生物有效態(tài)重金屬含量，使其向根部擴(kuò)散促進(jìn)植物吸收提取，并向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)［9-10］.Li等［2］研究表明施加EDTA顯著提高了土壤中酸溶態(tài)Cu，Zn，Ni，Cd和Pb的濃度，增加了黑麥草對(duì)重金屬的吸收，但因EDTA存在不易降解及浸出風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，其在聯(lián)合植物修復(fù)方面的應(yīng)用受到限制［11］.氨三乙酸（NTA）和乙二胺二琥珀酸（EDDS）等強(qiáng)化劑對(duì)環(huán)境的危害小，對(duì)土壤重金屬同樣具有較強(qiáng)的螯合作用，可改善植物對(duì)金屬的吸取性能，Mehrab等［12］和Wang等［13］發(fā)現(xiàn)NTA和EDDS的存在能夠顯著提升Cd在玉米和龍葵中的積累，但兩種螯合劑在土壤中降解過(guò)快［14］，需多次施加才能得到理想的強(qiáng)化修復(fù)效果［15］.因此，探尋新的生態(tài)安全的化學(xué)強(qiáng)化試劑，對(duì)重金屬污染土壤植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展具有重要意義.

N-十二?；叶啡宜猁}（LED3A）是在EDTA分子中引入疏水基團(tuán)而得到的螯合型表面活性劑，具有水溶性好、毒性小和易降解的特點(diǎn)［16］，OECD封閉瓶實(shí)驗(yàn)表明，30 d LED3A的生物降解率為70.5%［17］.本研究小組已有的研究發(fā)現(xiàn)，LED3A的親水氨羧配位基團(tuán)能夠有效螯合解吸土壤中的重金屬，形成穩(wěn)定的可溶性LED3A-金屬配合物［18］，其疏水碳鏈可以通過(guò)溶解膜脂使植物細(xì)胞的滲透性增加［19］，而表面活性亦能夠輔助改善土壤重金屬的生物有效性［20］，上述作用均有利于植物對(duì)重金屬的吸收、積累和轉(zhuǎn)運(yùn)［19，21］.因此，LED3A有望對(duì)土壤中的重金屬起到有效的活化作用，通過(guò)螯合誘導(dǎo)途徑強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤，并避免引起二次污染風(fēng)險(xiǎn).目前，有關(guān)LED3A聯(lián)合豆科牧草修復(fù)重金屬污染土壤的相關(guān)研究報(bào)道較少.

基于此，文中以模擬Cd污染土壤為基質(zhì)，以紫花苜蓿為供試植物，LED3A為強(qiáng)化試劑，進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn). 通過(guò)測(cè)定紫花苜蓿的生物量和生理指標(biāo)、土壤及紫花苜蓿中Cd的含量、植株中Cd的形態(tài)和亞細(xì)胞分布情況，研究LED3A強(qiáng)化紫花苜蓿修復(fù)Cd污染土壤的效果，探討LED3A強(qiáng)化植物修復(fù)Cd污染土壤的效能及作用機(jī)制，為螯合型表面活性劑誘導(dǎo)植物修復(fù)Cd污染土壤提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考.

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1? 試劑與儀器? LED3A（482 g·mol-1）購(gòu)自杭州生物科技有限公司；CdCl2·2.5H2O，HNO3，HCl和HF等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

TD6冷凍離心機(jī)，UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Varian 220FS火焰原子吸收分光光度計(jì)，GH-X09微波消解儀等.

1.1.2? 植物及土壤? 紫花苜蓿品種為“金黃后”，購(gòu)自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；土樣制備：土壤采自蘭州交通大學(xué)后山表層土（0～20 cm），基本理化性質(zhì)為：

pH=7.8，有機(jī)質(zhì)含量2.8 g·kg-1，陽(yáng)離子交換容量（CEC）4.9 cmol·kg-1，銨態(tài)氮1.2 mg·kg-1，有效磷9.3 mg·kg-1，速效鉀48.9 mg·kg-1，土壤未受到Cd污染.將采集的土壤自然風(fēng)干，剔除雜物后研磨過(guò)篩（2 mm）.然后在土壤中均勻混入CdCl2溶液，使土壤中Cd的濃度為15 mg·kg-1.

1.2? 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1? 盆載實(shí)驗(yàn)? 塑料盆（直徑14 cm，高度17 cm）中裝土1.5 kg，盆下帶托盤(pán)，溫室平衡（保持60%田間持水量）20 d后種植紫花苜蓿.實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，以未污染原土作空白（CK）對(duì)照，其他處理均為Cd污染土壤，采用不同濃度的LED3A（0（LN），160.7（LL），321.3（LM）和642.7（LH）mg·kg-1）進(jìn)行強(qiáng)化增效，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù).各處理在種植前施入400 mg·kg-1 磷酸二氫鉀和400 mg·kg-1尿素作為基肥，以保證紫花苜蓿生長(zhǎng).紫花苜蓿種子經(jīng)0.1% KMnO4消毒及浸種處理后，每盆播種100粒，發(fā)芽后間苗至60株，室溫培養(yǎng)（日溫22±5 ℃，夜溫15±5 ℃），每2 d澆一次水.植物種植90 d后，依據(jù)各處理設(shè)置濃度分別施入100 mL的LED3A溶液（pH值為7.8），強(qiáng)化作用7 d后收割紫花苜蓿.將植株分為地下和地上部分，測(cè)量并記錄長(zhǎng)度和鮮重，置于液氮中保存待測(cè)；收集土壤樣品，風(fēng)干研磨后密封保存待測(cè).

1.2.2? 測(cè)定指標(biāo)與方法? 植物生理指標(biāo)測(cè)定［22］：對(duì)植

物鮮樣，分別測(cè)定其地上部分光合色素含量、地下/地上部分丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性.植物/土壤中Cd的測(cè)定：取烘干（105 ℃殺青15 min， 50 ℃烘干）植物樣品采用HNO3-HCl微波消解后測(cè)定植物中Cd含量；取土壤樣品采用HNO3-HCl-HF微波消解后測(cè)定土壤中Cd含量.植物中Cd的形態(tài)和亞細(xì)胞分布測(cè)定：通過(guò)連續(xù)浸提法［23］提取并測(cè)定鮮樣中Cd的不同化學(xué)形態(tài)，包括乙醇提取態(tài)（FE）、蒸餾水提取態(tài)（FW）、氯化鈉提取態(tài)（FNaCl）、醋酸提取態(tài)（FHAC）、鹽酸提取態(tài)（FHCl）和殘?jiān)鼞B(tài)（Fr）；利用差速離心法［23］測(cè)定Cd在細(xì)胞壁（G1）、細(xì)胞質(zhì)（G2）和細(xì)胞器（G3）中的亞細(xì)胞分布情況.

1.3? 數(shù)據(jù)處理及分析

以富集系數(shù)（FBC）、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（FT）和積累量（UA）為指標(biāo)評(píng)價(jià)紫花苜蓿對(duì)土壤中Cd的提取能力：

FBC=CCsoil，（1）

FT=CshootCroot，（2）

UA=C×M，（3）

其中，C為紫花苜蓿地下部分（Croot）或地上部分（Cshoot）中Cd的濃度，單位為mg·kg-1DW；Csoil為土壤中Cd的濃度，單位為mg·kg-1DW；M為紫花苜蓿地上或地下部分的生物量，單位為g·pot-1 DW.

采用Excel 2016和Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，SPSS22進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異檢驗(yàn)（P<0.05）.圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；不同字母表示不同處理組之間存在顯著性差異（P<0.05）.

2? 結(jié)果與討論

2.1? LED3A對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)及光合色素含量的影響

從表1可以看出，Cd顯著抑制了紫花苜蓿的生長(zhǎng)（P<0.05），與CK相比，LN處理的根長(zhǎng)和株高分別降低了23.2%和17.8%，根與莖的鮮重分別降低了26.6%和35.5%.Cd的毒性效應(yīng)在多種植物中存在［24］，不僅抑制植物的光合和呼吸作用，減少水分和養(yǎng)分的吸收，而且通過(guò)誘導(dǎo)和抑制酶，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化以及擾亂代謝等途徑影響植物生長(zhǎng)［6］.可見(jiàn)，LN中植物生長(zhǎng)指標(biāo)降低是由Cd脅迫所致.施加不同濃度LED3A的各處理中，紫花苜蓿的長(zhǎng)度和鮮重較LN處理均有所增加，如表1所示.LL，LM和LH的植株長(zhǎng)度（41.30～43.65 cm）高于LN（37.42 cm），鮮重（0.830～0.924 g·plant-1）也大于LN（0.681 g·plant-1）.Habiba等［25］也報(bào)道了類似的研究結(jié)果，與Cu脅迫相比，EDTA和Cu共存能顯著提高甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）的生物量，EDTA與Cu2+形成的螯合物減輕Cu的毒性作用.在本研究中施加LED3A對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)狀況的改善，可能是由于LED3A促進(jìn)了植物對(duì)養(yǎng)分的吸收［26］，或LED3A-Cd螯合物的形成緩解了Cd對(duì)植物的毒性.

葉綠素和類胡蘿卜素是植物的兩種主要光合色素，可以反映環(huán)境因子對(duì)植物生長(zhǎng)狀態(tài)的影響［27］.表1各處理中紫花苜蓿光合色素含量的變化情況與其生長(zhǎng)參數(shù)的改變相似.LN處理組數(shù)據(jù)顯示，Cd脅迫使得葉綠素a，b和類胡蘿卜素含量分別較CK組降低了21.6%，18.1%和18.4%，而添加了LED3A的各處理中，光合色素含量較無(wú)添加處理LN有所回升，尤以葉綠素a的提高最為明顯，葉綠素b和類胡蘿卜素含量與LN之間差異不顯著.LL，LM和LH的葉綠素a含量較LN分別增加了6.9%，9.6%和12.8%（P<0.05）.這是由于Cd2+可以取代葉綠素結(jié)合位上的Mg2+導(dǎo)致葉綠素分子降解，或者通過(guò)抑制參與葉綠素生物合成的酶活性來(lái)降低葉綠素濃度［28］，而螯合劑的應(yīng)用可能增加植物地上部分Fe的濃度，影響葉綠素的結(jié)構(gòu)，減輕Cd對(duì)光合色素的破壞作用［29］.結(jié)果表明，Cd顯著抑制了紫花苜蓿的光合作用，LED3A的添加使光合色素含量升高，抑制程度有所緩解，在高濃度時(shí)（642.7 mg·kg-1）表現(xiàn)更為明顯.

2.2? LED3A對(duì)紫花苜蓿POD，SOD活性和MDA含量的影響

重金屬等環(huán)境脅迫可誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS），ROS通過(guò)攻擊胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和色素等，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化反應(yīng)生成MDA［30］.同時(shí)，植物體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生對(duì)氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，即增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)酶活性（如POD和SOD）以清除過(guò)多的ROS，維持自身的穩(wěn)定狀態(tài)［31］.

由圖1（a）和（b）可知，有/無(wú)LED3A添加的處理中，紫花苜蓿地下/地上部分POD和SOD活性均高于無(wú)污染的CK組，與無(wú)添加處理LN相比，LED3A對(duì)地下POD活性無(wú)顯著影響，可促使地上POD活性提高23.9%～34.8%.SOD對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)比POD更為敏感，活性變化幅度更寬.隨LED3A濃度增加，地下和地上部分SOD均呈現(xiàn)快速上升后趨于穩(wěn)定的狀況，較LN處理分別提高了19.0%～54.2%和55.4%～93.3%，其中以LM處理的增幅最大.植物中抗氧化酶的激活是具有重金屬高累積能力的植物生存的有力工具［25］，

Cd的存在促使紫花苜蓿提高抗氧化酶活性以耐受脅迫，LED3A與Cd共存亦會(huì)激發(fā)植物的抗氧化保護(hù)作用，通過(guò)不斷調(diào)節(jié)酶活性來(lái)增強(qiáng)抗性.有研究報(bào)道，Cu脅迫情況下EDTA的存在會(huì)提高甘藍(lán)型油菜幼苗體內(nèi)SOD，POD和CAT等抗氧化酶活性，進(jìn)而緩解氧化脅迫［25］.通常當(dāng)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS超過(guò)酶的清除能力時(shí)，二者之間的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，酶活性會(huì)迅速下降，植物細(xì)胞將受到損害.文中各處理的POD和SOD始終保持著較高的活性，表明在Cd和LED3A存在下，紫花苜蓿細(xì)胞仍處于穩(wěn)定狀態(tài)，植物生長(zhǎng)狀況良好.

圖1（c）中，LN處理植物地下/地上部分MDA含量較CK分別增加了21.0%和20.3%，表明紫花苜蓿根部和莖葉細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)受到的氧化損害程度相近，MDA對(duì)Cd的脅迫響應(yīng)較為明顯.添加LED3A的各處理中，MDA含量較無(wú)添加處理LN有不同程度的降低，其中LL的地下/地上部分MDA最低，分別為8.42和5.46 nmol·g-1.Xu等［32］的研究指出，與Cd污染處理相比，添加EDTA和有機(jī)酸后，水稻（Oryza sativa L.）中MDA含量降低.檸檬酸強(qiáng)化植物修復(fù)Cr污染土壤的研究同樣發(fā)現(xiàn)，“檸檬酸+Cr”可降低甘藍(lán)型油菜的MDA含量和電解質(zhì)滲漏［33］.LED3A可以緩解Cd誘導(dǎo)引起的植物氧化應(yīng)激，一方面是由于抗氧化酶活性的增加清除了過(guò)多的ROS，使膜脂過(guò)氧化水平有所恢復(fù)，MDA含量隨之下降；另一方面是LED3A-Cd絡(luò)合物被直接吸收，使植株內(nèi)Cd含量明顯提升，并以植物螯合肽的形式存在，從而降低了高活性Cd的形態(tài)占比，減輕了其毒性效應(yīng)［19］.低、中LED3A施加量下（LL，LM）紫花苜蓿體內(nèi)MDA含量降低較多，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害相應(yīng)減弱，與植物抗氧化酶保護(hù)和絡(luò)合態(tài)重金屬的吸收均有一定關(guān)系，應(yīng)該為兩種作用的綜合體現(xiàn).而高施加量處理（LH）中地下/地上部分MDA積累再度增多，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度有所加重，應(yīng)該與LED3A濃度對(duì)細(xì)胞膜滲透性的提高有關(guān)，但其值仍低于LN處理.

2.3? LED3A對(duì)紫花苜蓿中Cd的亞細(xì)胞分布及化學(xué)形態(tài)影響

重金屬在植物中的亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)可以反映重金屬的遷移能力及其植物毒性［34］.結(jié)合圖2（a）和（b）可以看出，無(wú)LED3A添加情況下（LN），植株地下和地上部分的Cd主要（50.0%和45.9%）分布在細(xì)胞壁G1中，其次是細(xì)胞質(zhì)G2（44.1%和39.3%），細(xì)胞器G3的占比很低（5.9%和14.8%）.這是由于植物細(xì)胞壁有許多負(fù)電荷位點(diǎn)可以與Cd2+結(jié)合，細(xì)胞壁的離子交換位點(diǎn)飽和后，金屬被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)并儲(chǔ)存在液泡中［35］.施加LED3A的各處理中，Cd（地下和地上）在G1，G2和G3各亞細(xì)胞組分中的含量較LN處理均有顯著提高（P<0.05）.

LED3A添加量為321.3 mg·kg-1（LM）時(shí)，對(duì)Cd在亞細(xì)胞組分間轉(zhuǎn)移的誘導(dǎo)效應(yīng)最為明顯，促使了更多的Cd由細(xì)胞壁向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移.對(duì)比LM與LN中Cd的亞細(xì)胞分布變化發(fā)現(xiàn)：首先，添加LED3A后，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)仍為Cd的主要分布場(chǎng)所，地下部分G1和G2中的Cd含量分別提高了25.9%和43.3%，地上部分則分別提高了45.4%和68.8%（圖2（a）），說(shuō)明紫花苜蓿細(xì)胞壁的固持作用和液泡區(qū)隔化對(duì)其耐Cd行為均發(fā)揮了功效;其次，LED3A促使Cd由G1向G2發(fā)生轉(zhuǎn)移，LM

中地下/地上部分的Cd在G1，G2中的含量及占比幾乎相等，與LN中以G1分布為主有所不同.液泡為細(xì)胞質(zhì)的動(dòng)態(tài)組成部分，約占細(xì)胞總體積的90%，植物液泡多被認(rèn)為是Cd的強(qiáng)富集位點(diǎn)［35］，可以推測(cè)LED3A與Cd共存時(shí)，液泡區(qū)隔成為紫花苜蓿耐受的主要機(jī)制.此外，由于LM處理的根部Cd濃度較大，地下部分G3中Cd的占比也提高了141.6%（圖2（a），（b）），這與Mehrab等［12］發(fā)現(xiàn)施用NTA后，Cd在玉米（Zea mays L.）葉片細(xì)胞器中的分布增加結(jié)果相似.

圖3（a）顯示了不同處理下紫花苜蓿體內(nèi)Cd的6種化學(xué)形態(tài)含量，施加LED3A的情況下，氯化鈉、醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)（FNaCl，F(xiàn)HCl，F(xiàn)HAc和Fr）Cd的含量，在地下/地上部分均有不同程度的增加，水提取態(tài)（FW）Cd含量變化不明顯，僅在根中乙醇提取態(tài)（FE）Cd含量有所下降，這是由于FE形態(tài)Cd在植物體內(nèi)遷移活性最強(qiáng)［34］，使其由地下轉(zhuǎn)移至地上造成.圖3（b）為不同處理下Cd的各形態(tài)占比情況，可以看出，添加LED3A提高了植株地下/地上部Cd的FHAc，F(xiàn)HCl和Fr 3種形態(tài)

的累計(jì)占比，相應(yīng)地FE，F(xiàn)w和FNaCl 3種形態(tài)占比下降.LL，LM和LH處理中，紫花苜蓿地下部分Cd的（FHCl+FHAc+Fr）形態(tài)比例較LN處理提高了11.7%～13.5%，而（FE+Fw+FNaCl）形態(tài)比例降低了15.2%～17.3%.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)NaCl形態(tài)為果膠/蛋白質(zhì)螯合Cd，可表征細(xì)胞壁（G1）中果膠和蛋白質(zhì)對(duì)Cd的固持作用；FHAc，F(xiàn)HCl和Fr可分別代表不溶的Cd-磷酸鹽、草酸Cd及殘?jiān)麮d，與細(xì)胞質(zhì)（G2）液泡中有機(jī)酸的絡(luò)合作用密切相關(guān)［36］.有關(guān)紫花苜蓿Cd的亞細(xì)胞分布討論中提出，LED3A可以促進(jìn)Cd由G1向G2轉(zhuǎn)移，而植物體內(nèi)（FE+Fw+FNaCl）形態(tài)組分向（FHCl+FHAc+Fr）形態(tài)組分的轉(zhuǎn)化也會(huì)隨之發(fā)生.由于FHAc，F(xiàn)HCl和Fr形態(tài)的Cd活性較弱［34］，意味著發(fā)生轉(zhuǎn)化后Cd對(duì)植物細(xì)胞和組織的傷害可能減小.綜上討論表明，LED3A降低了紫花苜蓿地下和地上部分高活性Cd形態(tài)的占比，減輕了Cd的植物毒性.

2.4? LED3A對(duì)紫花苜蓿吸收和積累Cd的影響

表2列出了不同濃度LED3A處理下，紫花苜蓿植株內(nèi)Cd的含量與積累量.可以看出，施用LED3A可顯著促進(jìn)紫花苜蓿對(duì)Cd的吸收和累積（P<0.05）.相較于LN處理，LL，LM和LH處理中地下/地上部Cd濃度和積累量均隨LED3A濃度增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).三個(gè)濃度LED3A強(qiáng)化作用下，紫花苜蓿體內(nèi)Cd含量分別提高了（地下+地上）21.5%，29.4%和23.9%，總Cd累積量分別提高了59.1%，69.1%和44.4%.LM處理效果最佳，其地下/地上部Cd含量分別為80.35和34.33 mg·kg-1，是LN處理的1.26和1.37倍；而地下、地上和總Cd積累量達(dá)到311.2，295.6和606.8 μg·pot-1，是相應(yīng)LN處理的1.65，1.73和1.69倍.LED3A增強(qiáng)植物修復(fù)的作用機(jī)制分析如下：其一，LED3A增加了土壤中有效態(tài)重金屬含量，使其向根部擴(kuò)散并被直接吸收，增強(qiáng)植物提取效果［21］；其二，LED3A的表面活性可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜滲透性，協(xié)同促進(jìn)根系對(duì)Cd的吸收積累，并通過(guò)植物蒸騰向地上轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存［19］；其三，螯合劑激活植物細(xì)胞質(zhì)膜上的ATP酶，引起重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的離子通道發(fā)生變化，從而促進(jìn)根系吸收，增加重金屬在植物地上部的積累［37］.高濃度LH處理下，LED3A強(qiáng)化效果較中濃度LM處理有所降低，可能是隨LED3A濃度增加，其疏水基彼此聚集并與土壤有機(jī)質(zhì)作用，致使Cd重新吸附在土壤顆粒上［38］.因此，在LED3A強(qiáng)化植物修復(fù)過(guò)程中，適宜的試劑用量能夠有效提高紫花苜蓿對(duì)污染土壤中Cd的提取效率.

2.5? LED3A對(duì)紫花苜蓿富集和轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的影響

紫花苜蓿對(duì)重金屬的富集及轉(zhuǎn)運(yùn)能力分別可以用FBC和FT值來(lái)表示.FBC值越大，植物對(duì)土壤中Cd的富集能力越強(qiáng)，修復(fù)污染土壤的效率越高;FT值越大，植物越容易將重金屬?gòu)母迪虻厣喜糠诌w移［2］.由圖4（a）可知，采用LED3A強(qiáng)化紫花苜蓿修復(fù)Cd污染土壤，植株地下/地上部分Cd的富集系數(shù)FBC，root/FBC，shoot均明顯提高（P<0.05），二者的變化規(guī)律與植株相應(yīng)部分Cd含量變化趨勢(shì)一致（表2）.LL，LM和LH處理中，F(xiàn)BC，root值分別為5.28，5.67和5.42，是LN處理

的1.20，1.29和1.23倍；FBC，shoot值分別為2.16，

2.36和2.25，是LN處理的1.25，1.36和1.30倍.與未添加LED3A的植物修復(fù)情況相比，LED3A在一定程度上促進(jìn)了Cd由地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)（P<0.05）.

圖4（b）表明，F(xiàn)T值從0.38（LN）增至0.42左右，提高了約10.5%，但LL，LM和LH處理間無(wú)顯著差異（P>0.05）.整體來(lái)說(shuō)，各處理中均出現(xiàn)FBC，root高于FBC，shoot，而FT值小于1的現(xiàn)象，表明Cd在紫花苜蓿根系中的富集高于地上部，可能是由于根部吸收速率大于向地上轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，使大部分Cd積累于根部所致.LED3A誘導(dǎo)植物從土壤中提取的Cd，半數(shù)以上被固定在根部細(xì)胞壁或分隔在液泡中，其余部分進(jìn)入到根中輸送水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的木質(zhì)部，隨后轉(zhuǎn)移到地上部分［39］.根據(jù)文獻(xiàn)［40］報(bào)道，高生物提取因子（FBC，shoot>1）有利于紫花苜蓿對(duì)土壤中Cd的提取，而高FBC，root、低FT更有利于紫花苜蓿的穩(wěn)定生長(zhǎng).根系Cd濃度高于地上部可能是植株在耐Cd與生長(zhǎng)之間平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果.

3? 結(jié)論

1）Cd脅迫下，紫花苜蓿的生長(zhǎng)和光合色素含量均降低.LED3A處理改善了紫花苜蓿的生長(zhǎng)狀況及地上部分葉綠素含量，提高了抗氧化酶POD和SOD活性，降低了MDA含量，從而緩解了紫花苜蓿植株由于Cd誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激.

2）細(xì)胞壁固持與液泡區(qū)隔化是紫花苜蓿應(yīng)對(duì)Cd脅迫的重要耐受機(jī)制，添加LED3A促使Cd從細(xì)胞壁向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，提升了紫花苜蓿地下/地上部分活性較弱的Cd形態(tài)（FHCl+FHAc+Fr）占比，減輕了Cd對(duì)紫花苜蓿的毒害作用.

3）LED3A對(duì)紫花苜蓿吸收、積累和轉(zhuǎn)運(yùn)Cd具有顯著的增效作用.321.3 mg·kg-1LED3A強(qiáng)化修復(fù)效果最佳，植株中Cd的總含量和積累量較無(wú)強(qiáng)化處理分別提高了29.4%和69.1%，F(xiàn)BC，root，F(xiàn)BC，shoot和FT相應(yīng)增加了28.6%，36.4%和10.5%.

4）LED3A可提高紫花苜蓿對(duì)Cd的耐受性，誘導(dǎo)強(qiáng)化紫花苜蓿提取富集土壤中的重金屬污染物，是一種頗具應(yīng)用前景的植物修復(fù)強(qiáng)化試劑.

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（責(zé)任編輯? 陸泉芳）