張懿翔，張清平，劉洋

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（乳及乳制品檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)） 上海 200233）

0 引 言

克羅諾桿菌為革蘭氏陰性菌，是一種普遍存在于自然中的條件致病菌，環(huán)境耐受性強(qiáng)，在嬰幼兒配方乳粉中存在克羅諾桿菌屬高污染風(fēng)險(xiǎn)[1-5]。6 個(gè)月以下的嬰幼兒易感染,可引發(fā)壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病,死亡率高達(dá)40%～80%[6-8]。目前檢測(cè)克羅諾桿菌屬的主要方法為傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要4～7 d，而且靈敏度低，對(duì)疑似菌株無(wú)法第一時(shí)間區(qū)分，在快速檢測(cè)中應(yīng)用受限。因此，為了有效地監(jiān)測(cè)乳粉安全，開(kāi)發(fā)快速且靈敏的克羅諾桿菌屬檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法——LAMP（loop-mediated isothermal amplification），通過(guò)設(shè)計(jì)4～6 條特異性引物，利用Bst DNA 聚合酶，可在等溫條件下高效擴(kuò)增目標(biāo)片段，并且對(duì)儀器的要求低，具有高效簡(jiǎn)便、靈敏度高、反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。但存在引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，存在多條引物相互作用以及氣溶膠造成的假陽(yáng)性問(wèn)題。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）檢測(cè)技術(shù)是利用Cas 蛋白反式切割活性，通過(guò)向?qū)NA 引導(dǎo)與靶標(biāo)結(jié)合并切割探針發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)快速靈敏檢測(cè)[12-19]。近年來(lái)，CRISPR 技術(shù)在分子檢測(cè)、病原菌檢測(cè)、植物育種、病毒檢測(cè)等生物技術(shù)領(lǐng)域均有應(yīng)用[20-27]。CRISPR 反應(yīng)受限于Cas 酶活和底物濃度[18]。

本研究基于CRISPR-Cas12b 蛋白，屬于第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的Ⅴ型，具有反式切割特性，靶向的模板為DNA，并反式切割單鏈ssDNA[28-29]。將LAMP 擴(kuò)增方法與Cas 蛋白檢測(cè)相結(jié)合，首先利用LAMP 進(jìn)行核酸擴(kuò)增，在向?qū)NA 引導(dǎo)下，Cas12b 產(chǎn)生對(duì)ssDNA 切割進(jìn)行檢測(cè)，在提高靈敏度的同時(shí)，也提高了特異性，結(jié)合了2 種方法的優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)嬰幼兒配方乳粉以及相關(guān)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的克羅諾桿菌屬進(jìn)行快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

選擇由上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供的8 株克羅諾桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株和33 株實(shí)驗(yàn)室分離菌株，以及30 株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的非克羅諾桿菌屬菌株，用于特異性檢測(cè)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂及阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司；NEBuffer 3.1(10×)、Warm Start LAMP Kit，NEB；RNA 酶抑制劑，Takara；UltraPureTM無(wú)核酸酶水，Thermo Fisher；Cas12b 蛋白，吐露港生物；細(xì)菌DNA提取試劑盒DP302-02，天根生化科技（北京）有限公司。所有LAMP 引物以及RNA 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems ABI7500，ABI7300)，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（DeNovix DS-11），美國(guó) DeNovix 公司；Vortex Genie2 漩渦振蕩器，德國(guó)Heidolph 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5430R)，德國(guó)Eppendorf 公司；移液器（2、10、100、1000 μL）（Eppendorf Research Plus），德國(guó)Eppendorf 公司；Bio 391 超凈工作臺(tái)，法國(guó)Erlab 公司；Milli-Q 超純水機(jī)，德國(guó)Merck 公司；生物安全柜，新加坡ESCO 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

使用Prokka 工具 (Seemann, 2014) 對(duì)Cronobacter sakazakiiATCC 29544 的基因組進(jìn)行注釋，尋找基因內(nèi)部的候選保守序列。針對(duì)克羅諾桿菌屬特異性關(guān)鍵基因序列利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 5.0以及Prime Express 分別設(shè)計(jì)LAMP 引物序列和向?qū)NA 靶向序列，經(jīng)過(guò)特異性及靈敏度測(cè)試，挑選效率最高和特異性最好的組合，序列如表1 所示。CRISPR反應(yīng)的報(bào)告探針為12 個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA 序列。

表1 引物與探針

1.3.2 DNA 提取方法

實(shí)驗(yàn)菌株：將菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中復(fù)蘇，36 ℃培養(yǎng)24 h，取2 mL 培養(yǎng)液，加入無(wú)菌離心管中，13 000 r/min，離心5 min，除去上清，取沉淀。然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

實(shí)驗(yàn)樣品：取乳粉樣品100 g 加入到900 mL 的BPW 中，混勻，36 ℃培養(yǎng)12 h。取2 mL 的樣品培養(yǎng)液加入無(wú)菌離心管中，3 000 r/min 離心10 min 去除上層脂肪層，然后13 400 r/min 離心10 min，取沉淀，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取[30]。

1.3.3 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

LAMP 反應(yīng)體系：先將引物用無(wú)核酸酶水稀釋至100 μmol/L，之后按如下比例配制（以100 μL 體系為例）FIP、BIP 16 μL，F(xiàn)3、B3 2 μL，LB1 4 μL，無(wú)核酸酶水補(bǔ)充至100 μL。反應(yīng)體系包括10 μL 2×WarmStart LAMP mix，LAMP primer mix （10 μmol/L）2 μL，DNA 模板（約50 ng/μL）1 μL，用超純水補(bǔ)足總體積為20 μL。LAMP 反應(yīng)條件：65 ℃反應(yīng)30 min，90 ℃反應(yīng)2 min 滅活；根據(jù)擴(kuò)增效果選擇最適宜的時(shí)間。

CRISPR 反應(yīng)體系：10×NEBuffer 3.1 2 μL，Cas12b（5 μmol/L）1 μL，crRNA（10 μmol/L），tracrRNA（10 μmol/L)和探針(10 μmol/L)各1 μL，RNA 酶抑制劑（40 U/μL）0.25 μL，待測(cè)DNA 模板2 μL，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足總體積至20 μL。ABI 7500 熒光PCR儀48 ℃，每1 min 檢測(cè)一次FAM 熒光，持續(xù)15 min。

1.3.4 特異性檢測(cè)

將收集到的41 株陽(yáng)性菌株和30 株非克羅諾桿菌屬陰性菌株，根據(jù)1.3.2 提取DNA。利用LAMP 對(duì)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，再使用CRISPR 反應(yīng)檢測(cè)。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

對(duì)核酸濃度為1×105、1×104、1×103、1×102、10、1、1×10-1pg/μL 的克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)?？肆_諾桿菌屬純菌液（102～107CFU/mL），取2 mL 菌液提取DNA 進(jìn)行檢測(cè)，獲得純菌液檢出限。

1.3.6 人工污染樣品的制備

選擇乳粉作為添加基質(zhì)，稱取100 g 加入900 mL BPW 緩沖蛋白胨水，均質(zhì)混勻。分別加入濃度為＜10，1×102，1×103，1×104CFU/mL 克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）菌懸液各1 mL。人工染菌后的BPW 增菌液36 ℃培養(yǎng)12 h，取各樣品勻液2 mL 提取核酸，進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 模擬生產(chǎn)環(huán)境樣品檢測(cè)

模擬生產(chǎn)環(huán)境樣品，在生產(chǎn)企業(yè)停產(chǎn)期間使用無(wú)菌棉簽對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行環(huán)境取樣，17 個(gè)地點(diǎn)、52 份模擬環(huán)境樣品。陽(yáng)性對(duì)照使用棉簽涂抹陽(yáng)性菌株（克羅諾桿菌屬（ATCC 25944））人工污染的平板，采樣的棉簽放入BPW 中經(jīng)過(guò)12 h 36 ℃增菌，然后提取核酸并檢測(cè)，并同時(shí)依照GB 4789.40—2016 進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.8 市售樣品檢測(cè)

為了考察實(shí)際樣品中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采購(gòu)市售不同廠家及日常檢測(cè)的嬰幼兒配方奶粉共計(jì)51 例。用本研究建立的方法對(duì)此51 份不同品牌的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)1.3.2 方法提取樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)。并用國(guó)標(biāo)方法GB 4789.40—2016 進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 反應(yīng)條件

對(duì)LAMP 時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果如圖1 所示，可以看到LAMP 反應(yīng)在10 min 左右開(kāi)始有擴(kuò)增信號(hào)，40 min之后會(huì)有一部分非特異性擴(kuò)增，故第一步擴(kuò)增時(shí)間選定為30 min。

圖1 LAMP 反應(yīng)時(shí)間

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如圖2～3 所示，所有克羅諾桿菌屬陽(yáng)性菌株均有明顯的擴(kuò)增信號(hào)，而其他常見(jiàn)陰性菌株的均沒(méi)有明顯擴(kuò)增信號(hào)，通過(guò)熒光信號(hào)的差異可以判定檢測(cè)結(jié)果。表明所設(shè)計(jì)的引物探針及向?qū)NA 靶向序列具有良好的特異性。

圖2 克羅諾桿菌屬陽(yáng)性菌株CRISPR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 靈敏度檢測(cè)

核酸水平檢出限結(jié)果如圖4 所示，本方法可以檢測(cè)到核酸水平100 ng/μL～0.1 pg/μL 的樣品，而單純LAMP 反應(yīng)如圖5 所示只能檢測(cè)到1 pg/μL，通過(guò)CRISPR 切割能獲得更高的靈敏度。純菌液檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示，本方法可以檢測(cè)到1×102CFU/mL 的純菌液，1×102～1×107CFU/mL 的菌液均有明顯熒光信號(hào)，可以穩(wěn)定檢測(cè)到1×102CFU/mL 的純菌液。

圖5 單純LAMP 檢測(cè)結(jié)果

圖6 純菌液樣品CRISPR 檢測(cè)結(jié)果

2.4 人工污染樣品的檢測(cè)

如圖7 所示，4 個(gè)不同污染水平的乳粉樣品均有明顯擴(kuò)增熒光信號(hào)，證明該方法可以檢測(cè)克羅諾桿菌屬初始含量為10 CFU/100 g 及以下的乳粉樣品。

圖7 CRISPR 方法對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)結(jié)果

2.5 模擬生產(chǎn)環(huán)境樣品檢測(cè)

對(duì)模擬生產(chǎn)環(huán)境樣品檢測(cè)，17 個(gè)地點(diǎn)、52 份模擬環(huán)境樣品，分別在2 個(gè)模擬污染地點(diǎn)的3 批次環(huán)節(jié)樣品中檢出阪崎克羅諾桿菌，與GB 4789.40—2016 方法的檢測(cè)結(jié)果一致，另有4 批次環(huán)節(jié)樣品在傳統(tǒng)分離方法中，阪崎腸桿菌顯色平板上出現(xiàn)了典型的疑似菌落，而本研究建立的CRISPR 方法檢測(cè)結(jié)果為陰性（未檢出），后續(xù)的生化鑒定結(jié)果均為非克羅諾桿菌屬。進(jìn)一步證明了該方法檢測(cè)的特異性較好，完全可以用于克羅諾桿菌屬的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.6 市售樣品檢測(cè)

本次所收集的51 批次奶粉，有4 批次為進(jìn)口奶粉，其余均為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的嬰幼兒配方乳粉，其產(chǎn)地來(lái)源于15 個(gè)省或直轄市（黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、新疆、河北、山東、天津、江西、湖北、湖南、浙江、上海）。使用本研究方法進(jìn)行檢測(cè)，51 份樣品均未檢出克羅諾桿菌屬，同時(shí)使用GB 4789.40—2016 進(jìn)行檢測(cè)，也均未檢出克羅諾桿菌屬，檢測(cè)結(jié)果一致。但是本研究的CRISPR 方法能夠大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且能排除非克羅諾桿菌屬對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

3 結(jié) 論

克羅諾桿菌屬是一種分布廣泛的食源性致病菌，在嬰幼兒配方乳粉的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中都存在污染風(fēng)險(xiǎn)，目前食品中克羅諾桿菌屬的檢測(cè)方法主要有常規(guī)培養(yǎng)法、熒光PCR 法等檢測(cè)方法[31-36]。傳統(tǒng)檢測(cè)方法,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程至少需要4～7 d，而且靈敏度低，對(duì)于疑似菌株無(wú)法第一時(shí)間區(qū)分。

本研究結(jié)合 LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增和 CRISPRCas12b 技術(shù)，建立了一種能夠快速檢測(cè)乳粉中克羅諾桿菌屬的新方法。所建立的檢測(cè)方法具有快速、靈敏、高特異、簡(jiǎn)便的特性，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，方法檢出限為<10 CFU/100 g。市售樣品檢驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，并且利用建立的方法對(duì)嬰兒配方食品企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的設(shè)備、環(huán)境和過(guò)程產(chǎn)品進(jìn)行采樣，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)結(jié)果一致，并且大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，排除疑似菌株的干擾。因此，本方法能夠?qū)θ榉鄣纳a(chǎn)過(guò)程進(jìn)行克羅諾桿菌的全流程篩選檢查，實(shí)現(xiàn)企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)快檢的目的。LAMP 技術(shù)與CRISPR 檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合在提高靈敏度的同時(shí)，也提高了特異性，儀器要求也不高，滿足了乳粉生產(chǎn)企業(yè)日常監(jiān)管與體系檢查的需要，節(jié)約了企業(yè)檢測(cè)成本與時(shí)間，能夠更有效地監(jiān)測(cè)乳粉安全問(wèn)題。在今后的研究中可將不同的Cas 蛋白運(yùn)用于乳品領(lǐng)域的CRISPR 檢測(cè)，做到一步法定量檢測(cè)、DNA 和RNA 相同步驟的快速分子檢測(cè)，進(jìn)一步將該技術(shù)在食品安全領(lǐng)域進(jìn)行創(chuàng)新性研究及應(yīng)用。