張鑫苗，伍國強(qiáng)，魏明

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

植物在生長發(fā)育周期中，經(jīng)常遭受非生物脅迫（低溫、干旱、鹽漬等）的侵害，通常這些逆境脅迫會對植物細(xì)胞造成一定程度的傷害，進(jìn)而對植物生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)造成不利影響［1］。因此，研究植物在逆境脅迫下造成的傷害及應(yīng)答機(jī)制對于提高植物的抗逆性具有重要意義。在長期的進(jìn)化過程中，植物逐漸形成了復(fù)雜而精確的系統(tǒng)，以適應(yīng)多變的環(huán)境條件［2］。其中，絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶網(wǎng)絡(luò)可以使植物感知環(huán)境、激素等外部因素刺激，并將其轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)妮敵?，如代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞生長和分裂變化等［3］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）屬于一類Ser/Thr 蛋白激酶，活化的MAPK 可靶向特定的下游底物，如激酶、酶和轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）磷酸化多種底物等［4］。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)控包括植物在內(nèi)的所有生物體內(nèi)許多基本細(xì)胞過程最重要的機(jī)制，一般通過級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。

MAPK 級聯(lián)由Ser/Thr 蛋白激酶的3 部分組成，包括MAP3Ks/MAPKKKs/MEKKs/MKKKs、MAP2Ks/MAPKKs/MEKs/MKKs 和MAPKs/MPKs，它們通過磷酸化順序激活，以在外部信號和細(xì)胞反應(yīng)之間傳遞和整合信息［5］。MAPK 級聯(lián)的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于MKK 與MAPK 的對接相互作用，以及MAPK 與底物的特異性相互作用［6］。目前，在植物中鑒定出各類蛋白激酶，其中最大和最重要的一類是MAPK。作為植物最重要的信號分子，MAPK 在傳感器或受體下游發(fā)揮作用，以協(xié)調(diào)細(xì)胞反應(yīng)［7］。研究表明，在外界各種逆境因子的刺激下，MAPK 級聯(lián)途徑在調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究對植物MAPK 的發(fā)現(xiàn)、分類與結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制及其響應(yīng)逆境脅迫等方面的研究成果加以綜述，并對其未來研究方向進(jìn)行展望，以期為農(nóng)作物抗逆性遺傳改良提供理論依據(jù)和基因資源。

1 植物MAPK 的發(fā)現(xiàn)

MAPK 在真核生物中具有重要作用，可介導(dǎo)多種外部信號在適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮作用，在植物中，MAPK途徑有著更廣泛的刺激［8］。植物MAPKs 是一類高度保守的Ser/Thr 類蛋白激酶。Stafstrom 等［9］在豌豆（Pisum sativum）中克隆出第一個高等植物MAPK 蛋白激酶編碼基因D5，該基因與酵母（Saccharomyces cerevisiae）和脊椎動物調(diào)節(jié)細(xì)胞周期MAPK 激酶約有50%的同源性，與植物細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cdc2 激酶約有41%的同源性。隨后，相繼在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［10］、萵苣（Lactuca sativa）［11］、水稻（Oryza sativa）［12］等植物中鑒定到MAPKs家族成員（表1）。不同植物MAPK編碼氨基酸數(shù)量為330～792 aa，分子質(zhì)量為38.21～90.12 kDa，等電點為4.93～9.28。

表1 不同植物MAPK 基因Table 1 The MAPK genes in various plant species

2 MAPK 的結(jié)構(gòu)與分類

MAPKs 是一類復(fù)雜的Ser/Thr 蛋白激酶，位于MAPK 級聯(lián)信號系統(tǒng)的下游，可以磷酸化多種底物，包括其他激酶和/或TFs［25］。MAPK 具有相對保守的11 個亞結(jié)構(gòu)域（Ⅰ～Ⅺ），均為Ser/Thr 蛋白激酶發(fā)揮其催化作用所必要的元件。MAPK 在Ⅶ和Ⅷ亞結(jié)構(gòu)域之間含有一個高度保守的“T-X-Y”活化環(huán)，“T-X-Y”基序也稱“T 環(huán)（Tloop）”，為MAP2K 磷酸化的保守基序，是決定MAPK 活性的關(guān)鍵部位［26］。根據(jù)“T-X-Y”基序，可將其分為TEY（Thr-Glu-Tyr）和TDY（Thr-Asp-Tyr）2 個磷酸化基序。其中，TEY 可進(jìn)一步分為A、B 和C 3 個亞簇，TDY 型的MAPK 成員單獨形成一個親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的D 簇，也是植物所特有的。目前對D 簇TDY 的功能研究較少但其成員數(shù)量較多［27］。另外，一些MAPK 成員還含有CD（common docking）結(jié)構(gòu)域，其保守基序為（LH）DXXDE（P）X［28］。此外，MAPK 底物蛋白上有一串帶正電荷的氨基酸殘基，由疏水性氨基酸殘基包裹，是MAPK 的?？课稽c。CD 結(jié)構(gòu)域是存在于MAPK 一級結(jié)構(gòu)中C 端與其他蛋白識別的位點，由一簇帶有負(fù)電荷的氨基酸殘基組成，與MAPK 活性中心對立。由于CD 結(jié)構(gòu)域帶負(fù)電荷而與MAPK 互作的蛋白停靠位點帶有正電荷，因此兩者之間的靜電作用可能是互作發(fā)生的重要原因［29］。

為進(jìn)一步分析進(jìn)化關(guān)系，本研究采用MEGA 11 軟件對來自擬南芥、山茶樹、煙草、甜瓜、甜菜（Beta vulgaris）和萵苣等6 個物種94 個MAPK 氨基酸序列進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，MAPK 成員可分為4 個亞簇，A、B、C 和D 簇分別含有17、22、14 和36 個成員。山茶樹、煙草、甜瓜和萵苣MAPK 在D 簇中成員最多，而甜菜MAPK 在B 簇的成員最多，在C 簇的成員最少。此外，處于同一簇的成員具有更高的同源性、基本結(jié)構(gòu)和功能相似性。由此表明，同一簇MAPK 的成員可能在不同植物中發(fā)揮相同的功能。A 簇MAPK 成員廣泛參與環(huán)境脅迫和激素響應(yīng)，B 簇成員主要參與環(huán)境脅迫響應(yīng)和細(xì)胞分裂，C 簇成員則參與細(xì)胞周期調(diào)控，而D 簇成員的功能尚不清楚［30］。

圖1 高等植物MAPKs 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the higher plant MAPKs

3 MAPK 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制

3.1 MAPK 級聯(lián)受信號分子的激活

3.1.1 MAPK 受活性氧的調(diào)控 在穩(wěn)態(tài)條件下，植物在活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生和淬滅之間保持著平衡，但當(dāng)植物遭受到生物或非生物脅迫時，ROS 的生成會加快［31］。逆境脅迫導(dǎo)致植物ROS，如過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）等過量積累［32］，造成氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而損害細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。鹽脅迫不僅對植物造成滲透和離子脅迫，而且還會造成氧化脅迫，從而抑制植物光合作用、養(yǎng)分吸收、蛋白質(zhì)合成和酶活性［33］。因此，高濃度ROS 對植物細(xì)胞是有毒害作用的。然而，應(yīng)激期間產(chǎn)生低濃度的ROS 被認(rèn)為是激活應(yīng)激反應(yīng)通路的信號分子［34］，從而控制各種生理代謝和細(xì)胞過程。眾多研究表明，在植物中ROS 信號傳導(dǎo)和MAPK 激活有著強(qiáng)烈的交織。

H2O2是關(guān)鍵的植物信號分子并可誘導(dǎo)MAPK 級聯(lián)響應(yīng)逆境脅迫。植物在鹽、低溫、干旱等非生物因素刺激下產(chǎn)生的ROS 導(dǎo)致MEKK1-MKK4/5-MPK3/6 激活以響應(yīng)逆境脅迫［35］。在玉米根中，鎘（Cd）脅迫通過ROS 誘導(dǎo)激活ZmMPK3-1 和ZmMPK6-1［36］。外源添加H2O2可激活擬南芥中的2 個A 亞簇成員（AtMPK6 和AtMPK3）［37］。H2O2還可激活煙草水楊酸誘導(dǎo)蛋白激酶（salicylic acid-induced protein kinase，SIPK）［38］、水稻OsMPK3、OsMPK6 和OsMPK1［39］。在OsMPK3 和OsMPK6 中鑒定的6 個保守半胱氨酸（Cys）殘基位于蛋白激酶亞結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅺ或其附近。Xie 等［40］利用定點突變技術(shù)，將Cys 替換成Ser，發(fā)現(xiàn)OsMPK3 和OsMPK6 的第4 個Cys 殘基分別為Cys179 和Cys210，可能是一個氧化還原敏感殘基，參與調(diào)節(jié)這兩個激酶的活性。Zhang 等［41］利用凝膠內(nèi)激酶法，用5 mmol·L-1H2O2處理作為底物的重組甘藍(lán)型油菜MKS1（擬南芥中鑒定的特定MPK4 底物的同源物）凝膠，在44 kDa 的BnMPK4 的預(yù)測位置觀察到單個放射自顯影帶，從而確定BnMPK4對H2O2有反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，BnMPK4 的激活機(jī)制是激活環(huán)中的Thr201 和Tyr203 殘基被磷酸化。MAPK不僅通過上游激酶高度保守的TEY 殘基的翻譯后磷酸化而被激活，轉(zhuǎn)錄控制也是植物MAPK 信號級聯(lián)的重要機(jī)制。Wang 等［42］通過免疫沉淀和凝膠內(nèi)激酶法測定證實，10 mmol·L-1H2O2能夠介導(dǎo)ZmMPK3 的激活。冷馴化誘導(dǎo)的番茄（Solanum lycopersicum）耐冷性主要歸因于凋亡細(xì)胞中呼吸爆發(fā)氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，RBOH）依賴性H2O2的產(chǎn)生，隨后激活MPK1/2 以誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)［43］。這些結(jié)果表明，逆境脅迫下植物產(chǎn)生的ROS 分子和外源施用H2O2可激活MAPK 途徑。

3.1.2 MAPK 受一氧化氮的調(diào)控 一氧化氮（nitric oxide， NO）被認(rèn)為是一種信號分子，高度參與植物的各種生理事件。NO 在O2存在下形成不同的重要氧化物，如NO2，其可與細(xì)胞胺和硫醇反應(yīng)，還可與O2·-反應(yīng)，產(chǎn)生的離子會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重傷害，這些分子也稱為活性氮物（reactive nitrogen species，RNS）。ROS 在植物細(xì)胞對生物和非生物脅迫反應(yīng)中的作用已被充分證明［44］。然而，對RNS 及其在植物中的作用知之甚少［45］。大量研究已經(jīng)揭示暴露于不利條件下植物中NO 介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制［46-48］。

NO 能夠賦予植物對重金屬、低溫、H2O2、高鹽等非生物脅迫的耐受性［49-50］。植物由于其固著性，在其生命周期中暴露于金屬和類金屬環(huán)境中［51］。許多重金屬都是植物必需的微量元素，對植物的生長發(fā)育起著十分重要的作用。但是，當(dāng)環(huán)境中的重金屬數(shù)量超過某一臨界閾值時，就會迅速變成毒性物質(zhì)，其通過干擾植物生理代謝，阻礙植物生長和發(fā)育并導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生［52］。研究表明，重金屬誘導(dǎo)MAPK3/6 活化是由NO 介導(dǎo)［53］。在擬南芥中，NO 通過促進(jìn)MPK6 介導(dǎo)的caspase-3-like 激活來促進(jìn)Cd2+誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）［54］。冷馴化誘導(dǎo)的番茄耐寒性與硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，NR）依賴的NO 產(chǎn)生和MPK1/2 的激活密切相關(guān)［55］。NR 是植物中NO 生成的關(guān)鍵因素，而NR 功能缺失則降低MPK1/2 和S-亞硝基化谷胱甘肽還原酶（S-nitrosylated glutathione reductase，GSNOR）活性，MPK1 和MPK2 功能缺失減弱NR 依賴的NO 產(chǎn)生和冷馴化誘導(dǎo)的低溫耐受性。相比之下，GSNOR 功能缺失則導(dǎo)致NR 活性降低，NO 積累量和MPK1/2 活性增加，增強(qiáng)對冷脅迫的耐受性。H2O2可誘導(dǎo)NO 的生物合成，導(dǎo)致MAPK 激活和基因上調(diào)，從而促進(jìn)抗氧化酶合成［56］。H2O2也可誘導(dǎo)玉米葉肉細(xì)胞中NO 生成增加，用NO-特異性熒光染料DAF-2DA 處理葉片后，采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）技術(shù)觀察到H2O2處理的玉米葉肉細(xì)胞中的DAF-2DA 熒光快速增加［57］。進(jìn)一步研究表明，NO 激活的MAPK 參與NO 誘導(dǎo)的玉米葉片抗氧化防御系統(tǒng)上調(diào)。用PD98059 和U0126（MAPKK 特異性抑制劑）預(yù)處理后，暴露于NO 供體硝普酸鈉（sodium nitroprusside，SNP），發(fā)現(xiàn)SNP 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平增加和抗氧化酶的活性幾乎被MAPKK 抑制劑預(yù)處理完全阻斷［57］。鹽誘導(dǎo)的應(yīng)激改變保護(hù)細(xì)胞的信號分子（如ROS、NO）。NO 通過調(diào)控乙烯（ethylene，ETH）生成和脫落酸（abscisic acid，ABA）信號途徑MKK2-MEK1-MAPK5 中的各種蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低ABA 水平和ETH 生物合成，進(jìn)而緩解高鹽對植物的毒害作用［58］。由此表明，NO 可能是通過自身或在其他信使的幫助下激活MAPK 信號通路，從而對逆境脅迫作出應(yīng)答響應(yīng)。

3.1.3 MAPK 受激素的調(diào)控 植物激素是一種重要的信號分子，其生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)常在細(xì)胞受到外界刺激時發(fā)生。植物對內(nèi)源刺激和外部刺激（如環(huán)境條件變化和病原體入侵）的感知，往往在短時間內(nèi)觸發(fā)MAPK 級聯(lián)反應(yīng)的快速激活［59］。這種快速的反應(yīng)可使其調(diào)節(jié)激素的生物合成或運(yùn)輸。植物激素的生物合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與MAPK 信號有著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，有些MAPKs 成員作為上游調(diào)控因子來控制激素的生物合成或運(yùn)輸［60］。然而，另外一些MAPKs 成員則位于下游，調(diào)控激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，MAPK 也可被水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和ETH 激活。

在擬南芥中，MAPKs 參與JA、ETH 和SA 的合成，以及ETH、SA、ABA 和JA 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［61-62］。Novikova等［63］研究表明，用ETH 處理過的擬南芥蛋白質(zhì)提取物中含有MAPK 活性，與野生型（wild type，WT）相比，該激酶在ctrl突變體中增加，而在etr1（對ETH 不敏感）突變體中降低。在鹽脅迫下，SlMAPK3過表達(dá)植株的鮮重、株高、根長均大于WT 和SlMAPK3-敲除植株。此外，轉(zhuǎn)基因植株ETH 信號通路基因（SlACS2、SlEIN2和SlERF2）的表達(dá)增加，從而對鹽脅迫作出積極反應(yīng)［64］。研究表明，JA 調(diào)節(jié)MAPK 活性和MAPK基因表達(dá)。甲基茉莉酸（methyl jasmonic acid，MeJA）是JA 的衍生物。研究表明，MeJA 可以通過提高抗氧化酶活性來增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抵抗力［65］。MeJA 強(qiáng)烈誘導(dǎo)甜瓜中14 個CmMAPKs［24］。用0.5 mmol·L-1MeJA 處理后，PtMAPK3-1的表達(dá)顯著上調(diào)，在12 h 達(dá)到最大值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊（Populus trichocarpa）轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性在MeJA 處理后12 h 均顯著增加，但過表達(dá)植株的水平高于野生型［25］。在SA 處理6 h 后，甘蔗（Saccharum officinarum）ShMAPK5轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)［66］。SA 和JA 可顯著誘導(dǎo)丹參（Salvia miltiorrhiza）SmMAPK3的表達(dá)水平［67］。

另外，MAPK 級聯(lián)反應(yīng)被褪黑素（melatonin，MT）觸發(fā)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，激活下游抗性基因的表達(dá)，從而提高燕麥（Avena sativa）對Cd 脅迫的耐受性［68］。在鹽脅迫下，外源MT 顯著增加了黃瓜（Cucumis sativus）CsMAPK3、CsMAPK4和CsMAPK6的表達(dá)水平［69］。在干旱條件下，外源乙酸（acetic acid，AA）激活蘋果（Malus domestica）ABA 信號通路ABA-PYR/PYL-PP2C-SnRK-MAPKK17/18-MKK3-MPK1/2 和JA 信號通路JA-MKK3-MPK6-MYC，使下游靶基因ERF和CHIB表達(dá)水平增加，從而提高蘋果的抗旱性［70］。這些結(jié)果表明，植物激素通過翻譯后修飾、激活TFs 和其他植物激素相互作用誘導(dǎo)MAPK 或MAPK 信號通路。

3.2 MAPK 級聯(lián)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子

植物MAPK 位于整個MAPK 級聯(lián)途徑的最下游，MAPKK 通過磷酸化的方式將信號傳遞給MAPK，被磷酸化的MAPK 在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化蛋白激酶或其他功能蛋白，或者進(jìn)入到細(xì)胞核中與TFs 相互作用進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。在MAPK 的諸多底物中，TFs 數(shù)量最多。TFs 也稱為反式作用因子，是一種能夠與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子［71］。當(dāng)植物受到非生物脅迫時，受激發(fā)的TFs 能夠與相應(yīng)啟動子的順式作用元件結(jié)合，以啟動應(yīng)答基因的激活或抑制，對非生物脅迫信號作出調(diào)節(jié)反應(yīng)，從而提高植物的抗逆性［72-74］。

目前，已發(fā)現(xiàn)與MAPK 級聯(lián)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有WRKY、bZIP、ERF 和ICE 等。 鹽脅迫下，水稻OsMAPKKK6-OsMAPKK4-OsMAPK5 級聯(lián)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子OsSERF1，該轉(zhuǎn)錄因子功能缺失會削弱MAPK 級聯(lián)和鹽耐受介導(dǎo)TFs 成員的基因表達(dá)。OsSERF1 是OsMAPK5 的磷酸化靶點，導(dǎo)致OsSERF1 對其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。OsSERF1 不僅激活下游轉(zhuǎn)錄因子OsDREB2A和OsZFP179表達(dá)，還能增強(qiáng)自身以及激活上游靶標(biāo)基因OsMAPK5和OsMAPK6表達(dá)［75］。MPK3 可將AT3（a C-terminal fragment of OXS2）磷酸化，磷酸化誘導(dǎo)的OXS2（oxidative stress 2）核定位對鹽脅迫反應(yīng)有積極作用［76］。MYC2 是一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helixloop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子成員，鹽脅迫下AtMKK3-AtMAPK6 級聯(lián)磷酸化AtMYC2。通過酵母單雜交（yeast one hybrid，Y1H）和電泳遷移率轉(zhuǎn)移測定（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）證實MYC2 與脯氨酸（proline，Pro）合成酶基因AtP5CS1（delta1-pyrroline-5-carboxylate synthase1）的5′-UTR 結(jié)合，抑制Pro 生物合成，從而調(diào)節(jié)鹽脅迫響應(yīng)［77］。

AtMPK3/AtMPK6 是低溫信號通路中重要的蛋白激酶，它們與轉(zhuǎn)錄因子ICE1（inducer of CBF expression 1）相互作用并使其磷酸化，降低CBF（c-repeat-binding factor）表達(dá)誘導(dǎo)因子ICE1 的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，負(fù)向調(diào)控下游靶標(biāo)基因CBFs和COR（cold-responsive）表達(dá)，從而影響植物對低溫的耐受能力［78］。在氧化脅迫下，ERF6 的Ser266 和Ser269 被AtMPK6 磷酸化后，結(jié)合ROS 響應(yīng)基因啟動子中的順式作用元件ROSE7/GCC box，從而調(diào)控ROS 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［79］。過量表達(dá)棉花（Gossypium hirsutum）GhMPK4使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱和鹽脅迫的耐受性減弱［80］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GhMAP3K15-GhMKK4-GhMPK6 磷酸化轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY59，該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控GhDREB2表達(dá)，以ABA 非依賴型的方式響應(yīng)干旱脅迫［81］。Chen 等［82］采用酵母雙雜交（yeast two hybrid，Y2H）技術(shù)研究證實，棉花中存在核和膜定位MAPK 級聯(lián)通路GhMAP3K62-GhMKK16-GhMPK32，其靶向并磷酸化核定位GhEDT1，以激活下游基因GhNCED3，介導(dǎo)ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和干旱反應(yīng)。另外，玉米ZmMPK6 磷酸化與ZmWRKY104 相互作用并被其磷酸化。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析表明，Thr59 是ZmMPK6 對ZmWRKY104 的主要磷酸化位點。Thr59 的磷酸化對ZmWRK104 在ABA 誘導(dǎo)的抗氧化防御中起至關(guān)重要的作用，ZmWRKY104過量表達(dá)可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性并減輕干旱誘導(dǎo)的氧化脅迫［83］。此外，過量表達(dá)小金蘋果（Malus xiaojinensis）MxMPK6-2可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對鐵（Fe）虧缺的耐受性［84］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MxbHLH104 可被MxMPK6-2 磷酸化，其磷酸化可增強(qiáng)蘋果愈傷組織在缺Fe 條件下對Fe 的吸收能力，ROS 存在也可促進(jìn)這一過程的發(fā)生［84］。水稻W(wǎng)RKY45 的活性受泛素蛋白酶體系的調(diào)節(jié)，其活性通過MAPK 介導(dǎo)的磷酸化來調(diào)節(jié)［85］。這些結(jié)果表明，MAPK 與下游轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活脅迫應(yīng)答基因來響應(yīng)逆境。

4 MAPK 級聯(lián)在植物響應(yīng)逆境脅迫中的作用

4.1 MAPK 級聯(lián)參與鹽脅迫響應(yīng)

鹽脅迫是制約作物生長和產(chǎn)量的主要非生物因素之一［86］。鹽分會對植物造成氧化應(yīng)激，離子毒性和營養(yǎng)失衡等不利影響［87］。相應(yīng)地，植物進(jìn)化出各種機(jī)制來抵御鹽脅迫。大量研究表明，MAPK 及其級聯(lián)途徑參與植物響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答（圖2）。毛果楊PtMAPK3-1［25］、野生大麥（Hordeum spontaneum）HsMPK8/11［88］、黃瓜CsMAPK3/4/6/9［89］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）StMAPK3［90］、山丹花（Lilium pumilum）LpMAPK［91］等信號通路均受鹽脅迫誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽環(huán)境反應(yīng)至少由兩個MAPK 級聯(lián)信號傳遞。Verma 等［77］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下MKK3-MPK6-MYC2 級聯(lián)激活和調(diào)節(jié)途徑，其中MPK6 在MKK3 下游起作用，MKK3 和MYC2 均是鹽脅迫誘導(dǎo)的MPK6 活化所必需的。鹽脅迫激活擬南芥MKK5-MPK3/6-ARR1/10/12 信號模塊，以提高耐鹽性。用 LC-MS/MS 技術(shù)對體外MPK3/6 磷酸化的ARR1/10/12 His 重組蛋白進(jìn)行分析，確定Thr553/Ser383/Ser323 分別是被MPK3/6 磷酸化的ARR1/10/12 的主要殘基［92］。Zhou 等［93］發(fā)現(xiàn)配體-受體對PAMP 誘導(dǎo)的分泌肽3（PAMPinduced secreted peptide 3，PIP3）和受體樣激酶7（receptor-like kinase 7，RLK7）在擬南芥植株耐鹽性中發(fā)揮重要作用。高鹽脅迫誘導(dǎo)prePIP3的表達(dá)，其編碼PIP3 肽配體的前體。PIP3 是植物耐鹽性的正調(diào)節(jié)因子，其功能依賴于RLK7。此外，RLK7 對PIP3 的感測導(dǎo)致MPK3 和MPK6 的激活。在prepip3 或rlk7突變體中，鹽誘導(dǎo)的MPK3/MPK6 激活減弱。因此，MPK3/MPK6 在PIP3-RLK7 配體-受體對下游的植物鹽脅迫反應(yīng)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。在鹽脅迫處理下，擬南芥愈傷組織中的MKK9-MPK3/6 級聯(lián)替代呼吸中的作用［94］。OsMPK4 與IPA1（ideal plant architecture 1）相互作用，并在Thr180 磷酸化IPA1，使IPA1 降解，從而對鹽脅迫作出應(yīng)答反應(yīng)［95］。體外激酶活性測定和蛋白質(zhì)互作發(fā)現(xiàn)，OsMAPKKK63 具有體外激酶活性，并且其激酶結(jié)構(gòu)域可與OsMKK1 結(jié)合，表明OsMAPKKK63 位于水稻MKK1-MPK4 級聯(lián)反應(yīng)上游，該級聯(lián)可通過調(diào)節(jié)鹽脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而參與水稻的鹽信號［96］。對鹽脅迫下野生大麥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，一個富集的MEKK1 模塊，如MEKK1-MKK2-MPK4/6、MEKK17/18-MKK3-MPK1/2/7/14 和-MKK3-MPK8 可有效調(diào)控植物對鹽脅迫的耐受性［88］。這些結(jié)果表明，MAPK 在作物耐鹽性抗逆遺傳改良中具有潛在的應(yīng)用價值。

圖2 MAPK 級聯(lián)響應(yīng)非生物脅迫Fig.2 MAPK cascade response to abiotic stress

4.2 MAPK 級聯(lián)參與干旱脅迫響應(yīng)

干旱是制約植物生長和發(fā)育的另一個主要環(huán)境因素。長期的干旱脅迫會導(dǎo)致植物光合速率下降，CO2吸收減少，生物量及產(chǎn)量降低。近年來，MAPK 在植物抗旱性中的作用備受學(xué)術(shù)界關(guān)注。在干旱脅迫下，燕山葡萄（Vitis yeshanesis）VyMAPK3表達(dá)水平顯著增加［97］。花生（Arachis hypogaea）AhMAPK13［98］、玉米ZmMPK3、ZmMPK5和ZmSIMK1［99］受干旱脅迫的誘導(dǎo)。研究表明，植物通過MAPK 級聯(lián)響應(yīng)干旱脅迫（圖2）。例如，棉花中存在一個典型的MAPK 級聯(lián)通路GhMAsP3K14-GhMKK11-GhMPK31，可對干旱脅迫作出響應(yīng)［100］。在另外一個MAPK 級聯(lián)通路GhMAP3K62-GhMKK16-GhMPK32 中，其靶向并磷酸化核定位轉(zhuǎn)錄因子GhEDT1，以激活下游GhNCED3，介導(dǎo)干旱反應(yīng)。過量表達(dá)GhMKK16可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株ABA 積累，并通過在干旱脅迫下調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉來增強(qiáng)耐旱性；而RNAi 則抑制ABA 積累，并降低了敲除植株的耐旱性［82］。在干旱條件下，過量表達(dá)GhMPK3使得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片相對含水量、離體葉片水分損失、葉綠素含量和離子泄漏等生理生化指標(biāo)優(yōu)于野生型植株［101］。在擬南芥中，通過MPK6-DCP1-DCP5 途徑脫帽的mRNA 活性來增強(qiáng)植物對干旱的耐受性［102］。MdMEK2-MdMPK6-MdWRKY17-MdSUFB 途徑在中度干旱脅迫下可穩(wěn)定蘋果葉綠素水平［103］。過量表達(dá)OsMPK17則使水稻幼苗的失水率下降，耐旱性增強(qiáng)［104］。另外，過量表達(dá)馬鈴薯StMAPK11使轉(zhuǎn)基因植株超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、CAT、POD 活性和Pro 含量增加，H2O2和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量降低，抗旱性顯著增強(qiáng)［105］。然而，并非所有的MAPK 正向調(diào)節(jié)植物對干旱的耐受性。在擬南芥中過量表達(dá)高粱（Sorghum bicolor）SbMPK14后，發(fā)現(xiàn)SbMPK14 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子ERF 和WRKY 活性提高了轉(zhuǎn)基因植株對干旱的敏感性［106］?？梢奡bMPK14 在干旱脅迫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。MPKL（MAPK-Like）是一個含有MAPK 標(biāo)記TxY 基序的激酶，在干旱條件下，過量表達(dá)玉米ZmMPKL1使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出氣孔孔徑增加、水分損失和葉片萎蔫加重等情況［107］。這些結(jié)果表明，MAPK 級聯(lián)途徑在正向或負(fù)向調(diào)控植物響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用。

4.3 MAPK 級聯(lián)參與極端溫度響應(yīng)

4.3.1 對低溫脅迫的響應(yīng) 低溫脅迫是限制植物生長和生產(chǎn)力的主要環(huán)境因素之一。大量研究表明，MAPK參與調(diào)控植物對低溫脅迫的響應(yīng)（圖2）。在擬南芥中，MAPKKK 蛋白AtANP1 在低溫脅迫下啟動與AtMPK3 的磷酸化級聯(lián)［108］。Chen 等［109］采用STRING 數(shù)據(jù)庫對荷花（Nelumbo nucifera）中MAPK 級聯(lián)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測NnMAPK 級聯(lián)NnMAP3K57-NnMKK5-NnMPK1/13 模塊與擬南芥MAPK 級聯(lián)模塊MEKK1-MKK2-MPK4 同源，與冷脅迫相關(guān)?？梢奙PK6 在介導(dǎo)MYB15 調(diào)控冷脅迫信號傳導(dǎo)中起重要作用。MKK4/5-MPK3/6 級聯(lián)組成型活性導(dǎo)致CBF表達(dá)量減少以及對低溫表現(xiàn)出超敏反應(yīng)；另外，MKK4/5-MPK3/6磷酸化ICE1，而ICE1 的降解則負(fù)向調(diào)控低溫耐受性［110］。MEKK1-MEK2-MPK4/MPK6 級聯(lián)參與植物對低溫的響應(yīng)，MKK2過表達(dá)使得MPK4 和MPK6 保持較高活性，以及使脅迫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)植物對凍害脅迫的耐受性［111］。這些結(jié)果表明，MPK3、MPK4 和MPK6 蛋白協(xié)同調(diào)控植物對低溫脅迫的響應(yīng)。

研究表明，水稻OsPP2C72 可以與OsMPK3 和OsbHLH2 相互作用，使OsMAPK3 和OsbHLH2 脫磷酸化，以防止OsMPK3-OsbHLH002-OsTPP1 模塊在冷應(yīng)激下的積極作用［112］。MnMPK5 正調(diào)節(jié)香蕉（Musa nana）的冷脅迫耐受性，MnMPK5的表達(dá)對多種脅迫條件有響應(yīng)。過表達(dá)MnMPK5的轉(zhuǎn)基因香蕉植株，在冷脅迫條件下Pro增加和MDA 降低，抗寒能力顯著增強(qiáng)［113］。棉花低溫脅迫響應(yīng)聯(lián)級GhMEKK3/GhMEKK24/GhMEKK11-GhMAPKK16-GhMAPK10/GhMAPK11 也參與鹽和干旱脅迫響應(yīng)［114］。AtMPK4 是參與緩解冷應(yīng)激的H2S 重要下游組分。NaHS（H2S 供體）處理之后，AtMPK4 活性增加近10 倍［115］。H2S 通過過硫化修飾AtMPK4 和增加AtMPK4 活性直接減輕冷應(yīng)激，這一過程也需要MPK4 參與調(diào)控冷響應(yīng)基因的上調(diào)表達(dá)和抑制氣孔打開來完成。過量表達(dá)ZmMPK17使轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)芽率提高、Pro 和可溶性糖含量增加，抗寒性顯著增強(qiáng)［17］。這些結(jié)果表明，不同物種在低溫脅迫反應(yīng)中MAPK 信號通路和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)之間存在一定的差異。

4.3.2 對高溫脅迫的響應(yīng) 在高溫環(huán)境下，植物正常生理機(jī)能會受到影響，從而加速細(xì)胞成熟老化。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，高溫會對作物產(chǎn)量造成重大損失。MAPK 信號通路除了參與低溫脅迫應(yīng)答外，也調(diào)控高溫脅迫響應(yīng)。在菊花（Chrysanthemum morifolium）中，葉片的CmMPK4.1、CmMPK6和CmMPK13表達(dá)受高溫脅迫快速誘導(dǎo)并顯著上調(diào)［116］。在熱脅迫下，StMAPK1、StMAPK2、StMAPK6和StMAPK19表達(dá)水平被誘導(dǎo)上調(diào)［117］。在萵苣中，大多數(shù)LsMAPKs對高溫脅迫有反應(yīng)，特別是LsMAPK4表達(dá)水平顯著上調(diào)［11］。在熱脅迫下，LsMAPK4功能缺失突變體植株莖長顯著低于WT 植株，花芽分化時間相應(yīng)延遲，抽薹速度變緩?？梢奓sMAPK4 在萵苣抽薹過程中起正向調(diào)節(jié)作用。在40 ℃高溫處理后，苦蕎（Fagopyrum tataricum）MAPK 家族成員FtMAPK1、FtMAPK5和FtMAPK8顯著上調(diào)，說明FtMAPK 級聯(lián)途徑積極參與高溫脅迫響應(yīng)［118］（圖2）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)遭受高溫脅迫時，F(xiàn)tMAPKKK4-FtMAPKK1-FtMAPK6 途徑被激活，與MYB 結(jié)合以增加類黃酮合成，從而減輕逆境脅迫對植物造成的傷害。番茄SlMPK1沉默致使RNAi 植株對高溫的耐受性增強(qiáng)，而過表達(dá)該基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株的耐受性降低，H2O2和MDA 積累量增加，抗氧化酶活性下降［119］。進(jìn)一步采用酵母雙雜交篩選，鑒定了一種富含Ser-Pro 的蛋白質(zhì)同源物SlSPRH1，通過雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技術(shù)證實SlMPK1 可以直接磷酸化SlSPRH1，在高溫脅迫下激活的SlMPK1 靶標(biāo)的關(guān)鍵磷酸化位點是SlSPRH1 的Ser44［119］。可見，SlMPK1 在番茄植物耐熱性中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。在熱應(yīng)激下，小麥TaMAPK 通過ROS 激活的信號傳感器調(diào)節(jié)熱應(yīng)激反應(yīng)［120］。這些結(jié)果表明，MAPK 在植物應(yīng)答高溫脅迫中起重要作用。

4.4 MAPK 級聯(lián)參與重金屬脅迫響應(yīng)

在自然界中，重金屬脅迫是對植物最具破壞性的環(huán)境因素之一。重金屬通過植物細(xì)胞中的靶向關(guān)鍵分子和重要過程產(chǎn)生毒性。MAPK 級聯(lián)通過磷酸化和去磷酸化將細(xì)胞膜表面受體感知的信號傳遞給細(xì)胞，并靶向各種效應(yīng)蛋白或TFs，從而導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)。大量研究表明，MAPK 參與重金屬（如Cu、Cd 等）響應(yīng)。

銅（Cu）是參與植物許多生理過程的必需微量元素。在Cu2+處理下，擬南芥幼苗根中的AtMPK3在處理2 h時被顯著上調(diào)，而AtMPK6轉(zhuǎn)錄水平在處理6 h 時短暫升高［121］。然而，過量Cu2+對植物是有毒的，其可激活細(xì)胞內(nèi)信號對細(xì)胞造成傷害。在玉米中，過多Cu2+使細(xì)胞內(nèi)H2O2水平快速升高，從而導(dǎo)致ZmMPK3 以及抗氧化酶（SOD、CAT 和APX）活性顯著增加［122］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二甲基硫脲（dimethyl thiourea，DMTU）通過阻滯Cu2+-H2O2-ZmMPK3-抗氧化酶信號通路，可有效抑制Cu2+引起的H2O2水平和ZmMPK3 以及抗氧化酶活性的增加。

Cd 是一種非必需元素，具有很強(qiáng)的毒性，其被植物根部吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，阻礙植物正常生長發(fā)育。為了抵御Cd 脅迫，植物進(jìn)化出復(fù)雜的防御系統(tǒng)［123］。近年來，MAPK 參與調(diào)控不同植物Cd 脅迫響應(yīng)的研究引起學(xué)術(shù)界關(guān)注。在玉米中，Cd 脅迫通過誘導(dǎo)ROS，從而激活ZmMPK3-1 和ZmMPK6-1［36］。在桑樹（Morus alba）中，MAPK 信號通路被激素（如ABA、JA 和ETH）激活，從而提高其對Cd 的耐受性［124］。在Cd 處理下，青蒿（Artemisia annua）AaMAPK3和AaMAPK10表達(dá)水平下調(diào)，而AaMAPK7、AaMAPK9和AaMAPK12表達(dá)水平上調(diào)［125］。在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，分別有7 個上調(diào)和3 個下調(diào)的MAPK 信號相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄變化，同時Cd 會引起水稻根系生長抑制，這與OsMAPK 負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)來抑制細(xì)胞周期有關(guān)［126-127］。在Cd2+脅迫下，構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）根中的BpMAPK轉(zhuǎn)錄本在3 h 時下調(diào)，而在6 h 時上調(diào)［128］。另外，在煙草中過量表達(dá)湖北海棠（Malus hupehensis）MhMAPK4后發(fā)現(xiàn)，MhMAPK4 通過限制轉(zhuǎn)基因煙草根部對Cd2+的吸收來降低植物體內(nèi)Cd2+積累，并通過調(diào)節(jié)液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）活性來控制Cd2+引起的細(xì)胞程序化死亡［129］。在Cd 處理下，番茄SlMAPK3被顯著誘導(dǎo)，過量表達(dá)該基因則顯著提高轉(zhuǎn)基因植株種子發(fā)芽率和改善幼苗生長狀況，增加葉綠素含量、根系生物量和根系活性［130］。另外，在擬南芥中，Cd2+還能快速刺激AtMPK6 活性，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)植物對Cd2+的耐受性［131］。此外，在鉻（Cr6+）處理下，水稻根系有1 個OsMAPK基因上調(diào)［132］；而在砷（As）處理下，過量表達(dá)OsMPK3和OsMPK16的細(xì)胞通過上調(diào)SOD、APX、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和醛氧化酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)對As 的應(yīng)激反應(yīng)［133］。這些結(jié)果表明，MAPK級聯(lián)參與重金屬激活的信號傳導(dǎo)。

5 展望

MAPK 級聯(lián)途徑在不同植物以及其生長發(fā)育的不同時期中對多種逆境都發(fā)揮了極其重要的作用。目前已有越來越多的MAPK 級聯(lián)途徑基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定，且研究方向主要集中于響應(yīng)環(huán)境信號的MAPK 級聯(lián)的鑒定及級聯(lián)途徑基因的分離和功能分析上。然而，逆境脅迫下MAPK 所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制研究得較少。因此，該領(lǐng)域未來研究可從以下3 個方面著手：1）深入探究MAPK 級聯(lián)途徑如何響應(yīng)外界刺激，及其與其他信號（ETH、ABA 和JA 等）途徑的交互作用機(jī)制；2）挖掘和鑒定MAPK 作用于下游的靶標(biāo)底物（其他蛋白激酶和TFs 等）及其磷酸化位點；3）深入解析MAPK 級聯(lián)調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的作用機(jī)制。隨著基因工程技術(shù)（過量表達(dá)、RNAi、miRNA 和基因編輯）的發(fā)展，逆境脅迫下MAPK 所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和作用機(jī)制將會被揭示，為農(nóng)作物抗逆性育種提供理論依據(jù)。