張偉才，劉肆仁，王尚農(nóng)

北京市第六醫(yī)院 1.心內(nèi)科；2.內(nèi)分泌科，北京 100007

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病主要的并發(fā)癥之一,由于高糖高脂持續(xù)刺激,心肌細(xì)胞發(fā)生糖脂代謝紊亂,氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡等病理改變,導(dǎo)致心功能障礙,最終發(fā)展為心力衰竭[1-2]?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多是DCM發(fā)生的主要機(jī)制,ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化引起心肌細(xì)胞損傷[3]。谷胱甘肽是細(xì)胞合成的最重要的非酶抗氧化劑,直接清除ROS。然而,DCM中谷胱甘肽含量減少,機(jī)制不清[4]。

硫化氫 (hydrogen sulfide, H2S)是內(nèi)源性氣體分子,心血管系統(tǒng)中主要由胱硫醚γ裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)產(chǎn)生[5-6]。在糖尿病心肌病中,H2S可以顯著降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平,保護(hù)心肌功能,其具制尚不清楚[7]。硫化氫是脂溶性氣體穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿,溶于水產(chǎn)生硫氫根離子在體內(nèi)發(fā)揮生理學(xué)作用。硫氫化鈉(NaHS)進(jìn)入體內(nèi)也解離成硫氫根離子,因此,人們常選擇NaHS作為硫化氫供體。本研究探討硫氫化鈉能否促進(jìn)谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白,改善心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胎牛血清(Gibco公司),棕櫚酸(palmitic acid, Pal) 、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS) 和DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycin,PPG)(Sigma-Aldrich公司)Anti-CSE、Anti-CBS(胱硫醚-β合成酶,cystathionine-β-synthase)、anti-SLC7A11(溶質(zhì)載體家族7成員11,solute carrier family 7 members 11),anti-GCLC(谷氨酸半胱氨酸連接酶C 亞基,glutamate cysteine ligase C),anti-GCLM(谷氨酸半胱氨酸連接酶M亞基),anti-GSS(谷胱甘肽合成酶,glutathione synthetase)(Proteintech公司,武漢,中國)。CCK-8細(xì)胞活力 (上海尚寶生物科技公司,上海,中國)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.2 小鼠心房肌細(xì)胞系HL-1[中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組與處理: 將HL-1細(xì)胞接種于含有DMEM培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合雙抗)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞增殖至90%匯合時(shí)進(jìn)行給藥處理。

將HL-1細(xì)胞隨機(jī)分組:1)正常對(duì)照組(control):10%胎牛血清DMEM:含25 mmol/L葡萄糖;2)高糖高脂組(HG+Pal):高濃度葡萄糖(HG):40 mmol/L;棕櫚酸(Pal):500 μmol/L;3)NaHS干預(yù):NaHS,100 μmol/L;4)GYY4137干預(yù):GYY4137是H2S緩釋釋放劑,10 μmol/L;5)PPG干預(yù):PPG是CSE抑制劑,1 mmol/L;6)NAC (N-acetyl-l-cysteine)干預(yù):NAC是ROS抑制劑,5 mmol/L。HL-1細(xì)胞經(jīng)加藥培養(yǎng)72 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力:將HL-1細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)24 h后,用含血清的DMEM配制Pal濃度(μmol/L)為0、200、500、1 000和2 000的培養(yǎng)液培養(yǎng)HL-1細(xì)胞,并檢測(cè)24、48和72 h后細(xì)胞的存活率變化。按試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)吸光度。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì): 取1×106HL-1細(xì)胞,加入含1%PMSF(蛋白酶抑制劑)的RIPA組織高效裂解液,低溫離心15 min,吸取上清液加入loading buffer,將蛋白樣放入金屬浴進(jìn)行蛋白質(zhì)變性,隨后將蛋白質(zhì)凍存。制備凝膠,上樣,90～130 V電泳,低溫轉(zhuǎn)膜1.5 h,用脫脂奶粉封閉2 h,加入抗體冷藏孵育過夜,洗膜3次,室溫孵育二抗1 h,采用多功能成像系統(tǒng)Fusion Fx5 spectra采集圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)吸光度分析,將目的蛋白條帶吸光度值與內(nèi)參蛋白質(zhì)條帶吸光度值的比值作為蛋白質(zhì)表達(dá)相對(duì)水平。

1.2.4 H2S探針檢測(cè)H2S的含量: 使用7-氨基-4-甲基香豆素(7-azido-4-methylcoumarin,C-7Az)熒光探針檢測(cè)HL1細(xì)胞中H2S含量。不同藥物處理后的HL1細(xì)胞,使用PBS清洗2次,加入C-7Az探針(50 μmol/L,PBS稀釋),37 ℃避光30 min,PBS清洗2次,在熒光顯微鏡下觀察H2S含量。

1.2.5 ROS 水平的檢測(cè):將HL-1細(xì)胞接種于24孔板中,加藥處理48 h后用 PBS 清洗3次。ROS 檢測(cè)試劑(μmol/L):DHE 和DCFH 用不含血清的 DMEM 配制。室溫下避光孵育30 min后使用 PBS 清洗3次,每次5 min。使用 Hoechst 對(duì)細(xì)胞核染色5～10 min。PBS 沖洗孔板中殘余染料3次,每次5 min。熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.6 谷胱甘肽含量的檢測(cè):將HL-1細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h后,加藥處理72 h。按試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀在412 nm處檢測(cè)吸光度。

1.2.7 免疫共沉淀檢測(cè):提取HL-1細(xì)胞蛋白質(zhì)后,使用 BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,根據(jù)定量結(jié)果將樣品稀釋至2 μg/μL,根據(jù)80 μg上樣量決定實(shí)驗(yàn)所需樣品體積。按照每1 mL樣品加入20 μL IgG瓊脂糖磁珠的比例加入磁珠,4 ℃搖床振蕩混勻30 min,使用磁力架去掉磁珠,將上清液轉(zhuǎn)移到新的 EP 管中,按照每1 mL樣品加入50 μL磁珠的比例再次加入磁珠,同時(shí)按照每1 mL樣品加入5 μL一抗的比例加入抗體,4 ℃ 搖床振蕩混勻過夜。隔天使用磁力架將上清液棄掉,加入含有PMSF的裂解液重懸磁珠,清洗3次。最后按照3∶1的比例加入裂解液和蛋白質(zhì)上樣緩沖液,100 ℃煮樣10 min。得到的蛋白樣品用 Western blot 檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 棕櫚酸對(duì)HL-1細(xì)胞活力的影響

500 μmol/L Pal培養(yǎng)72 h的HL-1小鼠心房肌細(xì)胞細(xì)胞生存率在50%,確定此濃度為最終濃度,作為2型糖尿病心肌細(xì)胞模型(圖1)。

Pal.palmitic acid; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group.圖1 棕櫚酸影響HL-1細(xì)胞的增殖Fig 1 Palmitic acid effected on HL-1 proliferation at 24,48 and 72

2.2 高糖高脂下HL-1心房肌細(xì)胞CSE表達(dá)水平

高糖高脂下CSE的表達(dá)和H2S含量明顯減少,NaHS干預(yù)后能夠恢復(fù)CSE的表達(dá)和H2S含量(圖2A和B)。

A.expression of CSE was detected by Western blot; B.content of H2S was test by fluorescence probe,C-7Az; *P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group.圖2 CSE蛋白表達(dá)及H2S含量測(cè)定Fig 2 Expression of CSE and H2S content were analyzed(n=3)

2.3 外源性H2S減少高糖高脂下HL-1心肌細(xì)胞ROS生成

與對(duì)照組相比,高糖高脂及PPG(CSE抑制劑)干預(yù)組ROS生成明顯增加,而NaHS和GYY4137(H2S緩釋釋放劑)干預(yù)后能減少ROS生成(圖3A和B)。

A,B.representative images of the fluorescence assay of ROS in HL-1cells using the fluorescent probe DCFH (green)and DHE (red);scale bar=50 μm.圖3 高糖高脂條件下細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化Fig 3 Contents of ROS in HL-1 cells with the treatment of HG and Pal

2.4 外源性H2S對(duì)HL-1谷胱甘肽生成的影響

與對(duì)照組比高糖高脂處理72 h,HL-1細(xì)胞谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基C(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基M(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)、谷胱甘肽合成酶(glutathione syn-thetase,GSS)蛋白的表達(dá)均明顯下降,NaHS和GYY4137干預(yù)后以上蛋白水平增加,加入PPG后明顯抑制相關(guān)蛋白表達(dá)的增加(P<0.01)(圖4)。

Pal.palmitic acid; PPG:DL-propargylglycin; HG:high glucose;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group; △P<0.05 compared with HG+Pal+NaHS group.圖4 Western blot檢測(cè)GCLC、GCLM和GSS的表達(dá)變化Fig 4 The expression of GCLC,GCLM and GSS was analyzed by Western

2.5 外源性H2S對(duì)高糖高脂下HL-1細(xì)胞谷胱甘肽含量的影響

與對(duì)照組比高糖高脂處理組心肌細(xì)胞中總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量減少,而氧化型谷胱甘肽含量增加;NaHS和NAC干預(yù)后,總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量增加;PPG處理后,總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量減少(P<0.01)(圖5)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group; △P<0.01 compared with HG+Pal+NaHS group.圖5 外源性H2S影響高糖高脂條件下GSH的含量變化Fig 5 Exogenous H2S modulating GSH contents in HL-1

2.6 外源性H2S調(diào)控心肌細(xì)胞Nrf2與Murf1的相互作用

Nrf 2在高糖高脂組的表達(dá)明顯降低,給予NaHS,其蛋白水平增加。與對(duì)照組和NaHS干預(yù)組比,高糖高脂條件下Murf1表達(dá)增加。高糖高脂和蛋白酶體抑制劑MG132處理心肌細(xì)胞后,Nrf2的泛素水平明顯增加,給予NaHS后,Nrf2的泛素水平明顯降低;高糖高脂條件下Nrf2 蛋白水平下降,與Murf1 增加Nrf2泛素水平,促進(jìn)其降解密切相關(guān)(P<0.01)(圖6)。

A.Western blot analysis of the expression of Nrf2 and Murf1; B.the ubiquitylation of Nrf2 was determined by CO-IP;C.CO-IP analyzing interaction between Nrf2and Murf1; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with HG+Pal group.圖6 外源性H2S影響Murf1與Nrf2的相互作用及Nrf2的泛素化水平Fig 6 Exogenous H2S effects on the ubiquitylation of

3 討論

1972年,Rubler在糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)在沒有冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓和心瓣膜病等危險(xiǎn)因素下發(fā)生的心臟功能下降,將這種心肌病命名為糖尿病心肌病。超過三分之一的糖尿病患者伴有心肌功能障礙,糖尿病心肌病顯著增加了患者心衰的發(fā)病率[8]。糖尿病心肌病是由高血糖、高血脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞代謝紊亂,其發(fā)生與胰島素代謝信號(hào)通路受損、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)的改變,促進(jìn)結(jié)締組織交聯(lián)、心肌纖維化增加和心臟重構(gòu)[11]。糖尿病患者體內(nèi)H2S的水平下降加重細(xì)胞損傷和ROS積累, 激活炎性反應(yīng)、促進(jìn)凋亡,最終加重糖尿病心肌病。外源性補(bǔ)充H2S能降低氧化應(yīng)激水平,減少心肌細(xì)胞凋亡[12],本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了外源性H2S減少高糖高脂條件下心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

谷胱甘肽是細(xì)胞合成的最重要的低分子量非酶抗氧化劑,含量豐富,是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要組成部分。其功能是維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài),以含硫醇的還原形式(GSH)存在,直接清除體內(nèi)過量產(chǎn)生的活性氧,并轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸问焦入赘孰亩蛎?glutathione disulfide,GSSG),后者在谷胱甘肽還原酶的催化下以NADPH作為底物還原成谷胱甘肽[13]。本研究發(fā)現(xiàn),硫氫化鈉明顯提高以上蛋白水平,從而提高還原性谷胱甘肽的含量。

核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的成員,有7個(gè)功能域(Neh1～7)參與其穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合蛋白。正常條件下,Keap1二聚體與Nrf2-Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,通過Cul3-Rbx1依賴性E3泛素連接酶活性使Nrf2泛素化而被迅速降解[14]。E3 連接酶肌肉特異性環(huán)指蛋白-1(muscle-specific RING finger protein 1, Murf1),是環(huán)指結(jié)構(gòu)域E3連接酶家族的一員,包含一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域 (RING finger domain),其在骨骼肌萎縮中發(fā)揮重要作用,此外也參與多種蛋白降解[15]。本研究證實(shí)在高糖高脂條件下Murf1與Nrf2存在相互作用,增加Nrf2泛素化;給予外源性H2S后,減少Nrf2泛素化。

本研究揭示NaHS減少糖尿病心肌細(xì)胞中Murf1的蛋白水平,降低 Nrf2的泛素化,促進(jìn)GSH合成,減輕高糖高脂條件下ROS的堆積。