廖鎮(zhèn)城，楊思懿，吳平安*

1.香港大學深圳醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 深圳 518000；2.深圳大學 醫(yī)學部，廣東 深圳 518000

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部的惡性上皮性腫瘤,多見于東南亞,具有高度侵襲和轉移的特性。中國發(fā)病地域差異大,主要分布于廣東、福建、香港等地,在華南、東南亞等流行地區(qū)發(fā)病率高達30/10萬[1]。表觀遺傳修飾是指基因功能發(fā)生可逆和可遺傳的改變,而不改變基因組DNA序列,如DNA甲基化、RNA甲基化和組蛋白乙?；?。研究表明,表觀遺傳調控在哺乳動物的胚胎發(fā)育、分化和疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。N6甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是 mRNA 序列中最普遍和最常出現(xiàn)的表觀修飾之一,這是一個動態(tài)可逆的修飾過程[2]。該過程由 METTL3、METTL14 和 WTAP 組成的甲基轉移酶復合物催化,也可被稱為“解碼器”的去甲基化酶 人類脂肪和肥胖相關(fat mass and obesity-associated,FTO)蛋白和 ALKBH5“擦除”[3]。隨著高通量測序技術的快速發(fā)展和表觀遺傳學研究的深入,m6A甲基化在各種生物進程中的作用引起了廣泛關注, m6A的研究逐漸成為生命科學領域最大的前沿研究熱點之一。大量研究表明,m6A通過調控mRNA剪接、穩(wěn)定性、翻譯效率等調控基因表達,調控microRNA加工等途徑,參與DNA損傷修復、干細胞分化、腫瘤發(fā)生等生物學過程[3]。

2011年首次發(fā)現(xiàn)FTO具有m6A去甲基化酶的活性[4],使m6A修飾成為類似于DNA甲基化和組蛋白乙?；膭討B(tài)可逆修飾過程。研究表明,FTO有助于癌干細胞的自我更新和免疫逃逸,也證明了FTO在靶向治療方面的潛力[5]。 有研究[6]發(fā)現(xiàn)FTO在人乳腺癌中上調,與乳腺癌患者較低的生存率顯著相關;在腎癌細胞中發(fā)現(xiàn)了 FTO 與腫瘤抑制因子VHL(Von Hippel-Lindau) 之間具有相互影響合成,致細胞死亡的作用[5]; 而m6A可提高胰腺癌細胞對化療和放療的抵抗能力[7]。另有研究表明m6A去甲基化酶FTO在癌的發(fā)生、發(fā)展中具有關鍵作用[8]。迄今關于m6A在鼻咽癌中的研究少之又少,尚未見有去甲基化酶FTO對鼻咽癌發(fā)生,發(fā)展中的作用的研究。本研究假設m6A去甲基化酶FTO在鼻咽癌的發(fā)生,發(fā)展中具有重要作用。本研究以期通過組織水平,蛋白水平,分子水平去驗證假設,發(fā)現(xiàn)去甲基化酶FTO在鼻咽癌中的表達水平低于癌旁組織。基于此進行了生物功能實驗,進一步探究FTO在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用,希冀能找到鼻咽癌治療的新方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本:鼻咽癌及癌旁組織標本(中國深圳 香港大學深圳醫(yī)院),所有樣本均采集自 2019年至2021年就診的患者,共82例,男性 47 例,女性 25例。標本入組條件:患者臨床診斷為鼻咽癌,且未接受過任何化療或放療。所有患者均知曉標本的去向和目的,并簽署知情同意書。香港大學深圳醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批件號:倫[2019]101。

1.1.2 細胞系與小鼠:人鼻咽癌細胞系CNE-1、CNE-2、5-8F來源于鼻咽癌(香港大學深圳醫(yī)院中心實驗室);人鼻咽癌細胞系C666-1和人永生化鼻咽癌細胞系NP69(上?？茖W院細胞庫);OE(僅代表5-8F過表達株) 來源于鼻咽癌(香港大學深圳醫(yī)院中心實驗室);6周齡雄性裸鼠(中國深圳 拓撲生物科技)。

1.1.3 試劑盒:10%胎牛血清、 RPMI-1640和補充有牛垂體提取物的角質形成細胞/無血清培養(yǎng)基(Gibco公司);過表達慢病毒(中國上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司);TRIzol試劑(Invitrogen公司);一抗FTO兔單克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司);NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) 試劑盒(Novoprotein公司);QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen公司);ECL 試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng):所有細胞系均在于37 ℃恒溫,含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),達到對數(shù)增殖期時收集。

1.2.2 構建質粒和穩(wěn)定轉染:通過中國上海吉凱基因購買FTO過表達載體,該過表達載體將完整的人FTO(NM-001363894)基因置于GV492載體中,以無FTO序列的空載體作為對照。 將合成的人FTO基因連接到過表達載體GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)上。重組慢病毒感染鼻咽癌細胞5-8F,用嘌呤霉素(2 μg/mL)篩選出穩(wěn)定表達成功的細胞株5-8F 0E。 所有轉染步驟均按照說明書進行。RT-qPCR和蛋白質免疫印跡分別驗證轉染后細胞中mRNA和FTO蛋白的表達水平。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中mRNA水平:使用 TRIzol 試劑從細胞中提取總 RNA,在-80 ℃的無RNA酶水中儲存。對于RT-qPCR,使用NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) (oncoprotein)試劑盒將總RNA合成第1鏈cDNA。核糖體蛋白S18的mRNA含量作為內部參照。FTO的引物序列為:正鏈5′-ACTTG GCTCCTTATCTGACC-3′,反鏈 5′-TGGTGCAGTGT GAGAAAGGCTT-3′。使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒進行擴增實驗。 反應條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,共40個循環(huán)。 所有實驗均運行3遍。 使用2-ΔΔCt方法計算FTO的相對表達水平。

1.2.4 免疫組織化學檢測鼻咽癌組織及癌旁組織中FTO蛋白:用4%多聚甲醛固定組織,經(jīng)過石蠟包埋,切片,切片機切成4 μm切片,將載玻片加熱至72 ℃,加入150 μL Dond dewax solution,孵育30 min,用酒精沖洗1次并用 Bond wash solution 洗滌1次,加入150 μL BOND epitope retrieval solution2,在100 ℃ 下孵育20 min,然后再次使用150 μL Dond dewax solution沖洗載玻片。打蠟3 min。室溫孵育 150 μL 1抗 FTO(1∶1 000 稀釋度;Proteintech),用 150 μL Dond wash solution 洗滌 3 次,室溫孵育150 μL一抗 8 min,150 μL Dond wash solution洗3次,每次2 min。加入15 mL辣根過氧化物酶,室溫孵育8 min,用Dond wash solution洗3次,再用去離子水洗1次,加入150 μL peroxide,室溫封閉5 min,用 Dond wash solution沖洗3次,再用去離子水洗1次。 預先準備好的 DAB Part1 和 DAB Part B,現(xiàn)場制備mixed DAB refine 150 mL,在室溫下孵育6 min,然后用 Dond wash solution洗滌3次。加入150 μL蘇木精,室溫孵育8 min。最后,在用去離子水沖洗2次,添加 Bond wash溶液以恢復藍色。后用乙醇脫水,脫蠟,并用中性膠固定在載玻片上。使用DAB顯示免疫復合物。最后顯微鏡攝影。

1.2.5 Western blot檢測細胞中的FTO蛋白:用 RIPA 裂解緩沖液從細胞系中提取蛋白質并測定目標分子的蛋白質水平。通過SDS-PAGE分離蛋白質,將蛋白質轉移到PDVF膜上。在室溫下用5% BSA封閉 1 h后,將膜與一抗孵育常溫過夜。用TBST溶液洗滌膜3次,每次5 min,并與二抗在室溫下孵育1 h。最終使用 ECL 試劑盒對蛋白質進行可視化攝影。

1.2.6 軟瓊脂集落增殖實驗:將10 000個FTO轉染細胞和陰性對照細胞接種在軟瓊脂平板上(下層瓊脂1.0%,上層瓊脂0.7%)。平板在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中增殖9 d,每 3 d更換1次培養(yǎng)基。在瓊脂上平鋪1層培養(yǎng)基防止干燥[9]。顯微鏡下隨機觀察拍照,計數(shù)大于0.1 mm的細胞集落數(shù)。

1.2.7 體內成瘤及增殖實驗:共10只6周齡雄性裸鼠分為兩組。隨機挑選5只小鼠,注射過表達FTO的鼻咽癌細胞5-8F OE,其余小鼠作為對照。所有動物實驗程序均經(jīng)香港大學深圳醫(yī)院倫理委員會批準。首先,計數(shù)3×106個5-8F OE NPC細胞和5-8F NPC細胞, 4 ℃冷藏,將不同組的細胞按組分別注射到小鼠腋前脂肪墊皮下[10]。裸鼠常規(guī)喂養(yǎng)2周,觀察腫瘤形成情況,每3～4 d測量腫瘤大小,直至最后1 d處死小鼠。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NPC組織和NPC細胞中FTO低表達

NPC組織中FTO蛋白水平降低(圖1A～C)。鼻咽癌細胞中FTO蛋白和mRNA水平低于NP69(圖1D,E)。這些結果均表明 FTO 在鼻咽癌細胞中低表達。

A.immunohistochemical picture of adjacent cancer tissue; B.immunohistochemical picture of nasopharyngeal carcinoma tissue; C.quantification of FTO tissue expression in immunohistochemistry; D.Western blot of each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69; E.relative expression of FTO mRNA in each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69;*P<0.05 compared with control group; MOD.mean oplical density.圖1 免疫組化與蛋白質印跡顯示FTO的表達情況Fig 1 Immunohistochemistry and Western blotting showed the expression of n=3)

2.2 過表達FTO 的5-8F抑制NPC細胞的增殖

成功構建1個過表達 FTO 的 5-8F 鼻咽癌細胞系OE,并通過qPCR進行驗證(圖2A)。軟瓊脂集落形成試驗表明FTO過表達抑制鼻咽癌細胞的增殖(圖2B,C)。

A. 5-8F was the control group, OE was the over-expression experimental group; QPCR showed that FTO was successfully over-expressed; B,C. soft agar proliferation experiment comparison chart and quantification chart;*P<0.05 compared with control group.圖2 FTO過表達抑制鼻咽癌細胞的增殖Fig 2 Over-expression of FTO inhibits the proliferation of n=3)

2.3 FTO在體內抑制腫瘤細胞增殖

成功建立了小鼠模型,觀察14 d,發(fā)現(xiàn)NPC細胞的成瘤性良好,過表達FTO的NPC細胞(OE組)增殖速度明顯低于對照組 (5-8F)(圖3A,B)。

A.in vivo tumor formation experiment in mice: comparison of the actual size of tumors taken from two groups of mice; B.comparative quantitative chart of tumor volume between two groups;*P<0.05 compared with control(5-8F) group.圖3 小鼠體內成瘤實驗表明過表達FTO降低了鼻咽癌細胞的增殖速度Fig 3 Tumorigenesis experiments in mice showed that over-expression of FTO reduced the proliferation rate of nasopharyngeal carcinoma cells in

3 討論

鼻咽癌的病因獨特而復雜,其發(fā)生發(fā)展的機制尚不完全清楚。目前公認的鼻咽癌高危因素包括EB病毒感染,高鹽高滲的飲食習慣,遺傳家族病史和某些人類白細胞抗原Ⅰ類基因型等[11]。當前m6A調節(jié)因子(閱讀器、 書寫器和擦除器)已成為研究熱點,其作用體現(xiàn)在多種癌中,包括人類乳腺癌[6]、腎癌[4]、胰腺癌[7]等。作為m6A調節(jié)因子擦除器之一的去甲基化酶FTO受到越來越多的關注,并在各種癌均見報道。研究表明 FTO 水平在肝癌組織和細胞中上調,FTO的過表達與肝癌患者個體的不良預后相關[12];也有研究發(fā)現(xiàn)FTO通過對長鏈非編碼RNA LINC00022的去甲基化促進了體內食管鱗狀細胞癌的腫瘤生長[13];在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中,發(fā)現(xiàn)了FTO通過m6A RNA修飾方式調節(jié)MALAT/miR-384/MAL2軸促進[14]。研究表明FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾抑制載脂蛋白E的表達,并可能通過調節(jié) IL-6/JAK2/STAT3信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌中的糖酵解代謝,從而消除腫瘤生長[15]。前人對FTO的研究表明,FTO在癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,既可以作為抑癌基因,也可作為癌基因發(fā)揮作用。然而,關于m6A調節(jié)因子在鼻咽癌中的表達方式和功能的報道非常少,關于去甲基化酶FTO與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展關系的研究目前尚未見報道。本研究研究證明了 FTO在鼻咽癌細胞中低表達,這與組織標本的表達趨勢是一致的,而過表達FTO可逆轉對鼻咽癌增殖過程中的促進作用,這與報道在對于FTO在甲狀腺乳突狀癌中的功能表達是一致的[15]。而FTO在膀胱癌,食管鱗狀上皮細胞癌的表達及功能卻是相反的,這可能存在細胞來源,培養(yǎng)壞境,操作偏倚等過程中的誤差。FTO在癌細胞中表達的高低和能否作為是調控癌細胞增殖的關鍵基因,還需要更多的生物學信息指導及明確其調空機制。本研究指出FTO在鼻咽癌細胞中低表達,并表明FTO具有抑制鼻咽癌的增殖能力,這一點在以往的研究中并未被發(fā)現(xiàn)。因此得出FTO在鼻咽癌中作為一個抑癌基因,在NPC進展過程中抑制鼻咽癌細胞的增殖,并表明 FTO可能是未來 NPC治療的有希望的靶點。

在本研究中,驗證了m6A甲基化酶中擦除器之一的 FTO在NPC低表達,促進了鼻咽癌細胞的增殖。過表達FTO逆轉了這種作用,抑制了鼻咽癌細胞的增殖。因此本研究得出FTO在NPC中作為一個抑癌基因,在NPC進展過程中抑制鼻咽癌細胞的增殖,并表明FTO可能是未來NPC治療的有希望的靶點。