田亞婷，張 芳，張博翔，李 甜

新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)胚胎學(xué)教研室；新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以高血糖為特征的一個(gè)日益嚴(yán)重的慢性代謝性疾病[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardomyopathy,DCM)是繼發(fā)于糖尿病的一種特異性心肌病,其獨(dú)立于高血壓性、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性或其他原因所致心臟病[2]。糖尿病心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是糖尿病心肌病晚期的主要病理變化之一,是引起心室重塑的重要原因。心肌中過(guò)多的膠原(Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)沉積會(huì)降低心臟順應(yīng)性,從而導(dǎo)致左心室硬度增加和收縮功能受損,最終導(dǎo)致心力衰竭[3]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是細(xì)胞增殖、分化、傷口修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)產(chǎn)生研究最多和有效的調(diào)節(jié)劑之一[4]。相關(guān)研究表明,TGF-β1的上調(diào)與糖尿病心臟的纖維化有關(guān),高葡萄糖可以增加TGF-β1活性,增加糖尿病大鼠心臟中的間質(zhì)纖維化和細(xì)胞肥大[5]。在正常生理狀態(tài)下,心臟中的TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量很低,但在高血糖、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等因素的刺激之下,體內(nèi)的TGF-β1及其受體的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化,使心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行分化,刺激膠原、纖維連接蛋白、蛋白多糖等物質(zhì)的合成,活化的TGF-β1會(huì)進(jìn)一步使細(xì)胞外基質(zhì)沉積,從而加重心臟的纖維化[6]。

馬里苷(marein)是從兩色金雞菊頭狀花序中分離得到,屬于黃酮類(lèi)化合物。有抑制糖尿病腎病的腎臟纖維化等作用[7]。經(jīng)查閱,兒茶類(lèi)化合物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1通路對(duì)心肌纖維化產(chǎn)生影響[8],但馬里苷是否通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1影響糖尿病心肌纖維化還未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題擬采用馬里苷干預(yù)糖尿病小鼠,觀察糖尿病小鼠心臟纖維化的改變,從而為馬里苷改善糖尿病心肌纖維化提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:5～6周齡自發(fā)性糖尿病SPF級(jí)db/db雄性小鼠和相同來(lái)源db/m雄性小鼠(江蘇常州卡文思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司),飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。在飼養(yǎng)小鼠時(shí),所需用品都經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒,并且符合國(guó)際動(dòng)物保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則和規(guī)則,合格證號(hào):IACUC-20190226-20。

1.1.2 主要試劑:馬里苷(Extrasynthese公司提供純度99.9%);二甲雙胍(metformin,Met)(MCE公司);基因引物序列(上海生工生物公司合成);兔抗fibronectin、vimentin抗體(Abcam公司);兔抗TGF-β(博奧森生物技術(shù)有限公司);兔抗GAPDH抗體(Affinity公司);蛋白質(zhì)marker(10～180 ku)(Thermo Fisher Scientific公司);Masson染色試劑盒(Solarbio公司);蘇木精染液(Biosharp公司)。

1.1.3 給藥試劑的配置方法:

1)羧甲基纖維素鈉溶液:稱取羧甲基纖維素鈉粉末0.0226 g,置于200 μL蒸餾水中,溶解后渦旋混勻,配成 2.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。

2)馬里苷給藥溶液:稱取25 mg馬里苷加入2.5 mL 2.5%羧甲基纖維素鈉溶液中,配置成10 mg/mL的混懸液,以50 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠灌胃給藥。

3)二甲雙胍給藥溶液:稱取0.53 g 二甲雙胍加入8.9 mL 2.5%羧甲基纖維素鈉溶液,以280 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠灌胃給藥。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組與藥物干預(yù):10只db/m雄性小鼠為對(duì)照組,將30只db/db鼠分成3組:10只db/db組,10只二甲雙胍和10只馬里苷陽(yáng)性藥干預(yù)組。根據(jù)前期課題組研究,計(jì)算出了二甲雙胍和馬里苷的適宜給藥劑量,二甲雙胍適宜給藥劑量為每日灌胃280 mg/kg,馬里苷適宜給藥劑量為每日灌胃50 mg/kg。

1.2.2 樣本收集:藥物干預(yù)8周以后,所有的小鼠禁食12 h,不禁水,過(guò)夜,頸脈脫臼處死小鼠。心臟組織標(biāo)本的收集:處死小鼠后,迅速取出其心臟,用眼科剪將心肌周?chē)闹窘M織和結(jié)締組織去除,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,并用吸水紙吸干多余的水分。將心肌組織放在培養(yǎng)皿中,切取長(zhǎng)約5 mm、橫截面積約1 mm2的組織塊,用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,置于1.5 mL干凈的凍存管-80 ℃保存。

1.2.3 HE染色觀察心肌組織形態(tài):用切片機(jī)將組織蠟塊切成約5 μm厚度的切片?？酒?脫蠟、梯度乙醇脫水。蘇木精染色5 min,1%的乙醇溶液中分化5 s,1%氨水水溶液返藍(lán)30 s,伊紅染色液1 min,放入80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無(wú)水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 s。封片、晾干,觀察并采圖。

1.2.4 Masson染色觀察心肌組織形態(tài):烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水。蘇木精染色5 min。酸性乙醇分化液分化8 s。藍(lán)化液返藍(lán)、麗春紅品紅染色,弱酸工作液清洗,磷鉬酸溶液洗1.5 min。滴加苯胺藍(lán)1 min,用蒸餾水沖洗終止染色,加入弱酸工作液。95%乙醇脫水2 s,無(wú)水乙醇分化7 s×3次,二甲苯透明1 min×3次。封片、晾干,觀察并采圖。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各心肌組織vimentin蛋白的表達(dá)水平:烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水。用H2O2除去內(nèi)源性過(guò)氧化物。磷酸鹽緩沖液浸泡5 min×3次。高火煮沸5 min,冷卻。血清37 ℃溫箱封閉。一抗覆蓋組織并放入4 ℃冰箱,過(guò)夜。 次日取出放置于室溫,用磷酸鹽緩沖液浸泡。二抗覆蓋組織,室溫孵育。磷酸鹽緩沖液浸泡。 DAB顯色、蘇木精染色,乙醇溶液中浸泡2 s,磷酸鹽緩沖液反藍(lán)、脫水、透明、封片、觀察并采圖。

1.2.6 Western blot檢測(cè)心肌組織纖連蛋白1(fibronectin 1,FN1)、vimentin和TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá):取出在-80 ℃冰箱中保存的心肌組織,加入組織高效蛋白裂解液,在冰上放置30 min,勻漿、裂解并離心,取出上清液,丟棄沉淀,并將其放在冰上進(jìn)行短期保存,或者將其放在-80 ℃的冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、敷一抗過(guò)夜。第2天,TBST沖洗、敷二抗、曝光、顯影,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察小鼠的心肌組織形態(tài)學(xué)改變

db/m組心肌組織結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞間質(zhì)未增大,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯;db/db組心肌組織出現(xiàn)了明顯的損害,心肌纖維肥大、腫脹、排列紊亂,部分心肌纖維斷裂,細(xì)胞間質(zhì)明顯腫大,局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象;二甲雙胍和馬里苷組,心肌結(jié)構(gòu)損傷有所改善,說(shuō)明馬里苷對(duì)心肌纖維化具有一定的保護(hù)作用(圖1)。

圖1 各組小鼠心肌組織HE染色結(jié)果Fig 1 HE staining results of myocardial tissue in each group

2.2 Masson染色觀察小鼠心肌組織的纖維組織改變

在 db/db組心肌組織中,膠原纖維的含量較 db/m組顯著增加(P<0.01);二甲雙胍和馬里苷組心肌組織膠原纖維表達(dá)明顯減少(P<0.01)(圖2)。

Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.圖2 各組小鼠心肌組織Masson染色結(jié)果Fig 2 Masson staining of myocardial tissues of mice in each n=6)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠心肌組織vimentin的表達(dá)

與 db/m組相比, db/db組小鼠心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有更多的黃色區(qū)域;與db/db組相比較,二甲雙胍和馬里苷組心肌胞質(zhì)中黃色區(qū)域減少(P<0.01)(圖3)。

2.4 馬里苷對(duì)心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

相對(duì)于db/m組,db/db組心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),二甲雙胍和馬里苷組心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1表達(dá)明顯降低(P<0.01)(圖4)。

FN.fibronectin; Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.圖4 各組小鼠心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達(dá)Fig 4 Expressions of FN1, vimentin and TGF-β1 protein in myocardial tissue of mice in each n=6)

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病發(fā)展到終末期的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥,是致糖尿病患者高病死率嚴(yán)重的并發(fā)癥[9]。在晚期高血糖會(huì)引起心肌結(jié)構(gòu)改變,心肌細(xì)胞壞死、心肌細(xì)胞間質(zhì)或血管周?chē)w維化、心肌肥大等現(xiàn)象[10]。有大量證據(jù)表明,糖尿病心肌病晚期的主要病理變化之一就是糖尿病心肌纖維化[11],但其機(jī)制仍不清楚。

前期研究結(jié)果證明,馬里苷可以使糖尿病小鼠血清胰島素、總膽固醇、三酰甘油有所降低,也具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng),以及預(yù)防高糖改善胰島素抵抗活性、抑制糖尿病腎病的纖維化的作用[12]。但馬里苷對(duì)糖尿病性心肌病的纖維化的作用尚不清楚。

TGF-β1是組織損傷后誘導(dǎo)這些膠原蛋白質(zhì)所需的細(xì)胞因子。大量實(shí)驗(yàn)表明,用TGF-β1刺激心肌成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞,并且使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉淀、Ⅰ型、Ⅲ型膠原過(guò)量合成,引起心肌纖維化。TGF-β1通過(guò)跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶激活Smads,連續(xù)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究可說(shuō)明TGF-β1與糖尿病心肌纖維化具有密切聯(lián)系,且馬里苷對(duì)糖尿病心肌纖維化具有一定保護(hù)作用。

在糖尿病心肌病中,成纖維細(xì)胞可能產(chǎn)生具有纖維化特性的特殊基質(zhì)蛋白如纖維黏連蛋白(FN),FN1為FN其中的一個(gè)亞型。FN1在高血糖的情況下是細(xì)胞外基質(zhì)的積累成分,FN的聚合緊密調(diào)節(jié)不同ECM蛋白的組裝,包括I型膠原蛋白[14]。Vimentin是一種常用的細(xì)胞標(biāo)志物,它以很高的靈敏度標(biāo)記成纖維細(xì)胞。為了表征成纖維細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞,通常使用vimentin[15]。FN1和vimentin蛋白在心肌中有較高的表達(dá),當(dāng)心肌發(fā)生纖維化時(shí)表達(dá)會(huì)明顯上升。研究表明馬里苷可以降低糖尿病db/db小鼠心肌組織FN1、vimentin、TGF-β1的表達(dá),改善心肌結(jié)構(gòu)的損傷以及心肌組織膠原纖維的沉積,馬里苷對(duì)糖尿病db/db小鼠心肌纖維化具有保護(hù)作用,具有一定的應(yīng)用價(jià)值,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。