王春燕，王 萍，宋龍飛，劉永全*，滿 君*

1.濰坊醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，山東 濰坊 261035；濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院 2.呼吸內(nèi)科；3.康復醫(yī)學科，山東 濰坊 261035

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) 是一種病因不明的慢性進行性疾病,以呼吸困難和肺功能進行性惡化為特征,預后差。目前研究認為IPF發(fā)病機制主要與上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)有關(guān),EMT指上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)變,細胞極性消失,遷移和侵襲能力增加的現(xiàn)象[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)是一類長度超過200 nt的非編碼RNA,可通過多種機制調(diào)節(jié)靶基因的表達[2]。長鏈非編碼RNA FEZ家族鋅指1-反義 RNA 1(lnRNA FEZ family zinc finger 1 antisense RNA 1,lncRNA FEZF1-AS1)在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用,研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)控細胞EMT過程相關(guān)的多種信號通路參與直腸癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤等疾病的病理過程[3-4]。然而lncRNA FEZF1-AS1與肺間質(zhì)纖維化的相關(guān)研究較少,本研究探討了lncRNA FEZF1-AS1調(diào)控zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog2, EZH2)在IPF中作用機制,為其治療提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人肺腺癌細胞系(human lung adenocarcinoma cell line)A549(上海富衡生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑:轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)(CA59,上海近岸生物科技有限公司);DMEM/F12液體培養(yǎng)基(HyClone公司);胎牛血清(賽默飛世爾科技中國有限公司);CCK-8檢測試劑盒(CK04,日本DoJinDo公司);Trizol和real-time PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司);引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司);FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、RIP試劑盒(廣州白薇生物科技有限公司);Si lncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和si NC(對照)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(廣州市銳博生物科技有限公司);OE(過表達) EZH2轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及OE vector對照轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(湖南優(yōu)寶生物科技有限公司);Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、EZH2及GAPDH抗體(Proteintech公司);HRP偶聯(lián)的二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:將A549細胞分為對照組(control)和肺間質(zhì)纖維化模型組(model,20 ng/mL TGF-β1作用48 h)。轉(zhuǎn)染組細胞分為轉(zhuǎn)染si NC組、si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組及si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2 組,每孔細胞轉(zhuǎn)染量約為3×105,轉(zhuǎn)染后立即加入TGF-β1,48 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測lncRNA FEZF1-AS1和EZH2 mRNA的表達水平:用Trizol試劑根據(jù)試劑盒說明從細胞中提取總RNA,按試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按試劑盒說明進行RT-qPCR反應,反應條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。記錄Ct值,采用2-△△Ct進行相對定量分析,以GAPDH作為內(nèi)參計算lncRNA FEZF1-AS1 mRNA和EZH2的表達量。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 primer sequences of RT-qPCR

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖:將細胞調(diào)整至4×104cells/mL,100 μL/well接種于96孔板,12 h后進行轉(zhuǎn)染,同時加入TGF-β1 20 ng/mL,放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在培養(yǎng)0、24和48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液并在培養(yǎng)箱中孵育4 h,使用酶標儀測定450 nm波長下各孔檢測的吸光度值。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移:將細胞懸液接種到6孔板中,細胞增殖至鋪滿孔底后,用 10 μL的無菌微量移液器吸頭垂直在消毒后在細胞板上劃痕,并將細胞洗滌3 遍,充分洗去漂洗細胞,加入無血清培養(yǎng)基,CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄0 h,48 h的劃痕面積。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞侵襲:制備細胞懸液,將細胞種入Transwell小室中,調(diào)整細胞濃度為2×105/mL,每組細胞數(shù)量為1×104個/well。配置Transwell上室液和下室液:上室加無血清培養(yǎng)基,下室是TGF-β 20 ng/mL含血清完全培養(yǎng)基,上室液每孔200 μL,下室液每孔800 μL。將上層小室放入下層小室,細胞計數(shù)后將細胞鋪在上層小室中。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,取出上室,用棉簽擦去上室底部膜表面上的細胞,PBS緩沖液洗滌后置于800 μL甲醇中固定10 min,采用吉姆薩染色液染細胞,熒光倒置顯微鏡計數(shù)、拍照。

1.2.6 Western blot檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白的表達:裂解液裂解每組細胞,于4 ℃下12 000 r/min離心15 min,提取細胞蛋白質(zhì),試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液煮沸5 min,放于-80 ℃保存。SDS-PAGE電泳分離后,用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜,加入一抗4 ℃孵育過夜,TBST充分洗滌PVDF膜后加入二抗37 ℃搖床孵育2 h。TBST洗滌后加入ECL顯影,用Image J軟件進行吸光度值分析,GAPDH作為內(nèi)參蛋白,計算目的蛋白表達量。目的蛋白質(zhì)表達量=目的蛋白質(zhì)條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值。

1.2.7 RNA免疫沉淀(RNA imunoprecipitation,RIP)檢測lncRNA FEZF1-AS1與EZH2 相互結(jié)合:根據(jù)RIP試劑盒說明進行RIP測定。將細胞在RIP裂解緩沖液中裂解,并與EZH2抗體(anti-EZH2)偶聯(lián)的磁珠或?qū)φ战M免疫球蛋白G抗體(anti-IgG)在4 ℃條件下孵育過夜。利用特異引物對提取的RNA進行RT-qPCR分析,以此方法檢測FEZF1-AS1的豐度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 模型組細胞E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白的表達

模型組(model)細胞中N-cadherin的蛋白和波形蛋白相對表達量高于對照組細胞(P<0.05);而模型組細胞中E-cadherin蛋白相對表達量低于對照組細胞(P<0.05)(圖1,表2)。

圖1 對照組和模型組細胞E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白的表達Fig 1 Expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in control group and model group

表2 對照組與模型組細胞E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表達水平的比較Table 2 Comparison of expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in control group

2.2 模型組細胞lncRNA FEZF1-AS1、EZH2 mRNA的表達

模型組細胞lncRNA FEZF1-AS1和EZH2 mRNA的表達高于對照組(圖2)。

*P<0.05 compared with control group.圖2 對照組和模型組細胞lncRNA FEZF1-AS1、EZH2 mRNA的表達Fig 2 Expression of lncRNA FEZF1-AS1 and EZH2 mRNA in control group and model group

2.3 CCK-8法實驗檢測細胞增殖

與對照組細胞相比,si NC組細胞增殖明顯升高(P<0.05);與si NC組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞增殖明顯降低(P<0.05);與si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2組細胞增殖明顯升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with si NC;△P<0.05 compared with si FEZF1-AS1+OE vector.圖3 各組細胞增殖比較Fig 3 Comparison of cell proliferation in each group

2.4 細胞遷移實驗

與對照組細胞相比,si NC組細胞遷移能力升高(P<0.05);與si NC組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞遷移能力降低(P<0.05);si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2組細胞遷移能力升高(P<0.05)(圖4,5)。

圖4 各組中細胞劃痕愈合的比較Fig 4 Comparison of cell scratch healing in each group (×100)

2.5 Transwell小室法實驗

與對照組細胞相比,si NC組細胞侵襲升高(P<0.05);與si NC組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞侵襲降低(P<0.05);與si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組細胞相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2組細胞侵襲升高(P<0.05)(圖6,7)。

圖6 各組中細胞侵襲的比較(結(jié)晶紫染色)Fig 6 Comparison of cell invasion in each group (crystal violet staining, ×100)

2.6 肺間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白的表達

Si FEZF1-AS1+OE vector組E-cadherin的蛋白表達高于si NC組(P<0.05);Si FEZF1-AS1+OE EZH2組E-cadherin的蛋白表達低于si FEZF1-AS1+OE vector (P<0.05); Si FEZF1-AS1+OE vector組組N-cadherin、vimentin的蛋白表達低于si NC組(P<0.05);Si FEZF1-AS1+OE EZH2組N-cadherin、vimentin的蛋白表達高于si FEZF1-AS1+OE vector組(P<0.05)(圖8)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with si NC group;△P<0.05 compared with si FEZF1-AS1+OE vector group.圖8 各組肺間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的表達Fig 8 Expression of fibrosis related proteins in each n=3)

2.7 EZH2蛋白的表達

Si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組EZH2的蛋白表達低于si NC組(P<0.05);Si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2組EZH2的蛋白表達高于si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector組(P<0.05)(圖9)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with si NC group;△P<0.05 compared with si FEZF1-AS1+OE vector group.圖9 各組EZH2蛋白的表達Fig 9 Expression of EZH2 protein in each n=3)

2.8 RNA免疫沉淀(RIP)測定

RIP實驗結(jié)果表明,EZH2抗體lncRNA FEZF1-AS1豐度(6.71±0.17)顯著高于對照組豐度(0.07±0.001)(P<0.05),表明了lncRNA FEZF1-AS1與蛋白EZH2具有直接結(jié)合作用。

3 討論

迄今研究認為IPF發(fā)病機制主要與EMT有關(guān),TGF-β1誘導因子可通過多種信號通路調(diào)節(jié)EMT,該方法是目前IPF細胞造模中較為成熟的造模方法。LncRNA由于其廣泛的生物調(diào)控功能,引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[5-6]。近年來不斷有研究報道,lncRNA在IPF中發(fā)揮重要作用,LINC00941/lncIAPF依賴ELAVL1/HuR通路阻斷自噬,促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,從而加速肺纖維化[7]。LncRNA CTD-2528L19.6通過介導纖維化相關(guān)基因的表達,促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)變[8]。LncRNA GAS5通過促進KDM5B介導的H3K4me2/3去甲基化抑制PDGFRα/β在IPF中的表達,從而抑制肺間質(zhì)纖維化的形成[9]。SNHG16通過靶向miR-455-3p調(diào)節(jié)Notch2通路從而促進肺纖維化[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FEZF1-AS1在多種腫瘤的EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11],但lncRNA FEZF1-AS1在肺間質(zhì)纖維化中的作用研究較少。本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)控EZH2從而促進EMT過程和肺間質(zhì)細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

EMT的典型特征是E-cadherin蛋白的抑制導致細胞黏附特性的喪失和間質(zhì)標志物的獲得,如N-cadherin、vimentin、fibronectin蛋白等,這些標志物使細胞黏附能力減弱,侵襲、遷移能力增強。E-cadherin是典型的上皮細胞標志物,介導細胞間的黏附,當E-cadherin表達減少時,細胞間的黏附作用減弱,導致上皮樣細胞向間充質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化,本研究結(jié)果也顯示了肺間質(zhì)細胞中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)控EZH2抑制E-cadherin的表達。N-cadherin和vimentin 是間質(zhì)細胞的重要標志物, 促進細胞黏附和轉(zhuǎn)移,本研究結(jié)果證實了lncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)控EZH2促進N-cadherin、vimentin的表達,因此本研究結(jié)果表明了lncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)控EZH2促進IPF中EMT的發(fā)生。

LncRNAs主要通過與蛋白相互作用以及作為microRNAs的海綿,在多種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。LncDACH1通過與基因SRSF1相互作用抑制CTNNB1的積累從而抑制肺纖維化,表明了lncDACH1可能是肺纖維化的潛在治療靶點[12]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1與CDC27相互作用,lncRNA TUG1的下調(diào)通過降低CDC27的表達和抑制PI3K/Akt/mTOR通路來改善肺纖維化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FEZF1-AS1的下調(diào)通過抑制EZH2的表達抑制EMT,從而減輕IPF的進展,且進一步采用RIP實驗證實了lncRNA FEZF1-AS1與EZH2具有結(jié)合作用。

綜上所述,本研究證明了lncRNA FEZF1-AS1通過與EZH2蛋白相互結(jié)合促進EMT過程使肺間質(zhì)細胞具有增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。