汪媛媛，朱席琳，伍曉盼，劉 英

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

男性不育是臨床上常見(jiàn)的復(fù)雜疾病,多種因素都可能導(dǎo)致不育。當(dāng)雄性生殖器官發(fā)育不良或生殖細(xì)胞發(fā)生障礙時(shí),即可失去原有的正常生殖功能,造成不育[1]?；罨D(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6, ATF6)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)期間激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)的靶基因。它通過(guò)順式作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件作為核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,該元件存在于編碼ER伴侶的基因的啟動(dòng)子中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)對(duì)睪丸和精子造成損害,導(dǎo)致不育[2]。

大多數(shù)熱休克蛋白廣泛表達(dá)并物種高度保守,嚴(yán)格表達(dá)對(duì)高熱、炎性反應(yīng)和感染等壓力的反應(yīng)[3]。熱應(yīng)激對(duì)睪丸最相關(guān)的后果是精子發(fā)生異常[4]。熱休克蛋白A1樣蛋白(heat shock protein family A member 1 like, HSPA1L)在睪丸中高度表達(dá),頂體后段和精子中段是其主要表達(dá)部位[5]。有研究表明,HSPA1L在低運(yùn)動(dòng)精子中的表達(dá)顯著下降,抑制HSPA1L可影響精子的形態(tài)和活力[6]。

本研究針對(duì)ERS過(guò)程的關(guān)鍵分子ATF6,探索ATF6調(diào)控生殖相關(guān)基因HSPA1L的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明,ATF6 能結(jié)合生殖相關(guān)基因HSPA1L的啟動(dòng)子進(jìn)而調(diào)控HSPA1L的表達(dá)。這有可能為預(yù)防或治療與ERS有關(guān)的男性不育的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與質(zhì)粒載體:人胚腎細(xì)胞系HEK-293T(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);ATF6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體為p3×-FLAG-CMV-14真核表達(dá)載體,TEX35 700、TSSK3 700、OAZ3 700、HSPA1L 700、SPATC1 700、HSPA1L 50啟動(dòng)子質(zhì)粒的載體為pGL3-Basic,均由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑:DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清FBS,非必需氨基酸NEAA(Gibco公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司);超純RNA提取試劑盒,RIPA Lysis Buffer(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司);RT-qPCR引物(天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司);抗ATF6抗體,抗HSPA1L抗體(Proteintech公司);抗GAPDH抗體(Affinity公司);山羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術(shù)公司);細(xì)胞核/質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒(愛(ài)必信生物科技有限公司);化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司);凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)探針(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:細(xì)胞培養(yǎng)使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基+1%NEAA,在恒溫37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖期的HEK-293T細(xì)胞接種至24孔板,細(xì)胞匯合度70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,使用Lipofectamine 3000試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,將HEK-293T細(xì)胞分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載對(duì)照質(zhì)粒)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染ATF6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 篩選ATF6下游生殖相關(guān)基因:取4周齡的雄性ATF6敲除小鼠和雄性野生型小鼠的睪丸組織,提取RNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序由實(shí)驗(yàn)室前期研究完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果篩選受ATF6正向調(diào)控的生殖相關(guān)基因。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(dual luciferase reporter gene assay):將HEK-293T細(xì)胞與SV40,Flag-ATF6,空載體和生殖相關(guān)基因的啟動(dòng)子質(zhì)粒在24孔板中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染。48 h后,使用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)和Promega GloMAX 96微孔板發(fā)光儀分析熒光素酶活性。

1.2.4 生物信息學(xué)分析:使用在線網(wǎng)站Gene-Regulation ALiBaba2.1(http://www.gene-regulation.com)對(duì)目的生殖相關(guān)基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)RNA表達(dá):采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)ATF6和HSPA1LmRNA的相對(duì)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所需引物如下:ATF6上游引物 5′-CCCAAGACTCAAACAAACT C-3′,下游引物 5′-GTGATTAGGGAGCTGTGTGA-3′;HSPA1L上游引物 5′-TTACCGTGCCAGCCTATTTCA-3′,下游引物 5′-AGCACATTAAGTCCAGCAATCA-3′;GAPDH上游引物 5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′,下游引物 5′-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3′。

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá):使用帶有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)樣品用10% SDS-PAGE,然后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上,并在室溫下封閉在5%脫脂奶粉中2 h。之后,將膜與一抗(稀釋比均為1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天與HRP偶聯(lián)的二抗(稀釋比1∶10 000)進(jìn)一步孵育2 h。使用ECL法曝光顯影,檢測(cè)ATF6和HSPA1L蛋白的表達(dá)。

1.2.7 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合:提取細(xì)胞核蛋白質(zhì),根據(jù)1.2.4預(yù)測(cè)的結(jié)合序列設(shè)計(jì)相關(guān)EMSA探針。本實(shí)驗(yàn)所用探針如下:生物素標(biāo)記的探針:HSPA1L啟動(dòng)子探針5′-biotin-TATAAGTCGTC ACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補(bǔ)探針5′-biotin-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATA-3′;未標(biāo)記的探針:HSPA1L啟動(dòng)子冷競(jìng)爭(zhēng)探針5′-TATA AGTCGTCACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補(bǔ)探針 5′-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACT TATA-3′;突變的HSPA1L啟動(dòng)子冷競(jìng)爭(zhēng)探針5′-TATAACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補(bǔ)探針 5′-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTTATA-3′。將探針與互補(bǔ)探針1∶1混勻,生物素標(biāo)記的探針終濃度為100 nmol/L,未標(biāo)記的探針終濃度為10 μmol/L,100 ℃退火形成雙鏈探針,自然冷卻。將蛋白質(zhì)與探針混合制樣,樣品在0.5×TBE中用4%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至尼龍膜上,0.5×TBE作為轉(zhuǎn)膜液,380 mA,轉(zhuǎn)膜45 min。紫外交聯(lián)儀選擇在254 nm紫外波長(zhǎng)處,120 mJ/cm2,交聯(lián)50 s。 封閉洗滌后,采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATF6過(guò)表達(dá)效率驗(yàn)證

HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATF6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,ATF6的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)(圖1A)。孵育ATF6抗體,與對(duì)照組的內(nèi)源性ATF6相比,ATF6蛋白表達(dá)量也明顯升高(P<0.05)(圖1B, C)。

Flag.p3×-FLAG-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-FLAG-CMV-14-ATF6; A.real-time PCR analysis of the mRNA expression of ATF6 *P<0.05, **P<0.01 compared with Flag group.圖1 過(guò)表達(dá)ATF6后mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化Fig 1 Changes in mRNA and protein expression after over-expression of n=3)

2.2 轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序篩選出ATF6下游基因

根據(jù)本課題組前期轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序結(jié)果(BioSample accession: SAMN18643078)[7],篩選出與精子發(fā)生功能相關(guān)的睪丸特異性表達(dá)基因。為進(jìn)一步縮小篩選范圍,按照差異的顯著性小于0.05,選擇受ATF6正向調(diào)控的下游基因。最后,本研究選擇SPATC1、TEX35、TSSK3、OAZ3、HSPA1L作為候選基因。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定ATF6對(duì)HSPA1L啟動(dòng)子活性促進(jìn)最顯著

候選基因的啟動(dòng)子熒光質(zhì)粒由5′UTR序列和其上游的700 bp啟動(dòng)子序列構(gòu)成。其中啟動(dòng)子活性較高的2個(gè)基因?yàn)門(mén)EX35和HSPA1L(圖2A)。 ATF6過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了TEX35(P<0.001)和HSPA1L(P<0.001)的啟動(dòng)子熒光素酶活性,且ATF6對(duì)于HSPA1L啟動(dòng)子的促進(jìn)效果最為明顯(圖2B),最終確定HSPA1L為所研究的ATF6下游靶基因。

SPATC1.pSPATC1-700; TEX35.pTEX35-700; TSSK3.pTSSK3-700; OAZ3.pOAZ3-700; HSPA1L.pHSPA1L-700; Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.dual-luciferase reporter assay analysis of the relative promoter activity of five different promoters B.HEK-293T cells were co-transfected with ATF6 plasmids and TEX35, HSPA1L promoters; Luciferase assays in indicated cells *P<0.001 compared with Flag group.圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)比較啟動(dòng)子活性Fig 2 Comparison of promoter activity by dual luciferase reporter gene n=3)

2.4 預(yù)測(cè)ATF6結(jié)合HSPA1L啟動(dòng)子的位點(diǎn)并檢測(cè)ATF6對(duì)截短啟動(dòng)子活性的影響

Gene-Regulation ALiBaba2.1(http://www.gene-regulation.com)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在HSPA1L700啟動(dòng)子序列上與ATF結(jié)合位點(diǎn)的序列為aagtcgtcac(圖3A)。根據(jù)預(yù)測(cè)到的結(jié)合序列,構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)及其前后各20 bp的啟動(dòng)子50 bp質(zhì)粒(圖3B)。過(guò)表達(dá)ATF6對(duì)截短的50 bp啟動(dòng)子活性仍有顯著的促進(jìn)作用(P<0.001)(圖3C)。

HSPA1L-50.pHSPA1L-50; Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.the binding site of ATF to HSPA1L promoter; B.schematic diagram of HSPA1L 50 promoter plasmid; C.HEK-293T cells were co-transfected with ATF6 plasmids and truncated HSPA1L promoters; Luciferase assays in indicated cells; *P<0.001 compared with Flag group.圖3 確定ATF與HSPA1L啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)Fig 3 Determination of the binding site of ATF to HSPA1L n=3 )

2.5 過(guò)表達(dá)ATF6可使HSPA1L的表達(dá)上調(diào)

HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATF6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組HSPA1L的mRNA(P<0.001)(圖4A)和蛋白(P<0.05)表達(dá)均顯著增加(圖4B, C)。這與前述ATF6促進(jìn)HSPA1L啟動(dòng)子活性的趨勢(shì)相一致。

Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.real-time PCR analysis of the mRNA expression of B.Western blot showed the protein expression of HSPA1L, ATF6; C.relative protein levels of HSPA1L and ATF6 detected by densitometry *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Flag group.圖4 過(guò)表達(dá)ATF6促進(jìn)HSPA1L的mRNA和蛋白表達(dá)Fig 4 Over-expression of ATF6 promoted the mRNA and protein expression of n=3)

2.6 ATF6 蛋白與HSPA1L的啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合

ATF6與HSPA1L啟動(dòng)子aagtcgtcac序列產(chǎn)生結(jié)合條帶,當(dāng)加入冷競(jìng)爭(zhēng)探針時(shí)結(jié)合條帶消失,而加入突變的冷競(jìng)爭(zhēng)探針時(shí)出現(xiàn)結(jié)合條帶,證實(shí)了ATF6蛋白與HSPA1L啟動(dòng)子DNA有相互作用(圖5)。

EMSA was used to detect the binding of ATF6 to HSPA1L promoter;wt.wild type; mut.mutant圖5 ATF6蛋白與HSPA1L的啟動(dòng)子DNA序列相結(jié)合Fig 5 ATF6 protein bound to the promoter DNA sequence of HSPA1L

3 討論

ERS通過(guò)調(diào)節(jié)不同應(yīng)激條件下的自噬和細(xì)胞凋亡來(lái)維持生存與死亡之間的平衡。有研究表明,睪丸中的熱應(yīng)激是男性不育的主要原因之一,與活性氧(reactive oxygen species, ROS)過(guò)量產(chǎn)生和誘導(dǎo)睪丸精子凋亡有關(guān)[8]。持續(xù)熱應(yīng)激誘導(dǎo)睪丸 Leydig 細(xì)胞的ERS會(huì)阻斷 Leydig 細(xì)胞中睪酮的合成,從而影響精子的發(fā)生[9]。這些研究結(jié)果證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激除了能影響精子,還能影響附睪中的生殖細(xì)胞和激素合成,從而導(dǎo)致男性不育。目前,ERS激活下游UPR信號(hào)通路已成為研究生殖細(xì)胞生存和凋亡的重要內(nèi)容之一。

人類HSP70(HSPA)家族由13個(gè)成員組成,這些成員的氨基酸序列、亞細(xì)胞定位和表達(dá)水平各不相同[10]。在HSP70家族中,HSPA1L被認(rèn)為是一種“睪丸特異性”熱休克蛋白,在精子中高度表達(dá)[11]。同時(shí),有研究表明,HSPA1L對(duì)于雄性生殖至關(guān)重要,HSPA1L磷酸化可保護(hù)雄性生殖細(xì)胞免受熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。已有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2],但目前關(guān)于HSPA1L與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間是否存在某種關(guān)聯(lián)尚不清楚。

本研究以ERS的關(guān)鍵分子ATF6探討其對(duì)生殖相關(guān)基因HSPA1L的調(diào)控作用,將為預(yù)防或治療與ERS有關(guān)的男性不育的深入研究奠定基礎(chǔ)?；谵D(zhuǎn)錄物組測(cè)序的結(jié)果,將HSPA1L定為研究對(duì)象,探究ATF6對(duì)下游基因HSPA1L表達(dá)的影響。在HEK-293T細(xì)胞中驗(yàn)證了ATF6 可以促進(jìn)HSPA1L啟動(dòng)子的活性,并在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ATF6真核表達(dá)質(zhì)粒后,HSPA1L在mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平均隨之上調(diào)。EMSA實(shí)驗(yàn)也顯示,ATF6蛋白可以和HSPA1LDNA相互作用,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了HSPA1L的表達(dá)受到ATF6的調(diào)控。

本研究存在一定的局限性。由于轉(zhuǎn)染效率問(wèn)題,最終選擇轉(zhuǎn)染效率較高的HEK-293T細(xì)胞系進(jìn)行關(guān)于ATF6 如何調(diào)控HSPA1L的分子機(jī)制研究。但實(shí)際上,HSPA1L主要在睪丸的精子細(xì)胞中表達(dá),在腎臟、脾臟等器官中也有表達(dá),但表達(dá)量較低。因此,HEK-293T 細(xì)胞不一定是本項(xiàng)研究中在細(xì)胞系上的最佳選擇。但是在一定程度上可以推測(cè),在HSPA1L表達(dá)程度更高的細(xì)胞中,ATF6對(duì)其調(diào)控的分子機(jī)制很有可能是相似的。

綜上所述,本研究表明,在HEK-293T細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)ATF6可以通過(guò)結(jié)合HSPA1L啟動(dòng)子上調(diào)HSPA1L的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。這將為進(jìn)一步研究預(yù)防或治療與ERS有關(guān)的男性不育奠定基礎(chǔ)。