李慶菊，于 然，陳佳佳，陳皓瑜，宋 堅，王萬鵬*

1.南京醫(yī)科大學(xué)康達學(xué)院附屬醫(yī)院 漣水縣人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223400；2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，江蘇 揚州 225009；3.江蘇護理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223400

造影劑腎病(contrast-induced nephropathy; CIN)屬于含碘造影劑誘導(dǎo)的腎毒性急性腎損傷(acute kidney injury;AKI),是造成醫(yī)源性腎功能衰竭的重要原因,目前仍缺乏有效的治療手段[1-2]。自噬是一種溶酶體降解途徑,可通過形成自噬小體和自噬溶酶體來降解損壞的細(xì)胞器。研究發(fā)現(xiàn),自噬在AKI中具有重要作用,在AKI急性期,近端腎小管細(xì)胞通過誘導(dǎo)自噬啟動內(nèi)在保護機制[3]。近年來證實,組蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4;HDAC4)的上調(diào)可促進AKI的發(fā)生,可能與介導(dǎo)自噬相關(guān)[4]。但是在造影劑碘佛醇(ioversol)誘導(dǎo)的AKI中,自噬的激活及自噬對HDDC4的影響目前還不是很清晰。據(jù)此,本研究以造影劑誘導(dǎo)的AKI(contrast-induced acute kidney injury;CI-AKI)大鼠模型為研究對象,旨在探討自噬對CI-AKI的調(diào)節(jié)作用及潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性SD大鼠24只,質(zhì)量200～220 g(上海必凱科翼生物科技有限公司[SCXK(滬)2018-0006])。

1.1.2 試劑:碘佛醇(恒瑞醫(yī)藥有限公司;320 mg 碘/mL);雷帕霉素(rapamycin;RAPA)和羥基氯喹(hydroxychloroquine;HCQ)(MCE生物技術(shù)有限公司);血清肌酐(serum creatinine; Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen; BUN)試劑盒(南京建成生物研究所);蘇木精-伊紅(Sigma-Aldrich公司);戊二醛(SPI-Chem公司);鋨酸(Ted Pella公司);p62抗體和LC3抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);HDAC4抗體(武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司);Triol試劑(Ambition公司);SYBR green染料(鎮(zhèn)江愛必夢生物技術(shù)有限公司);引物合成(上海生工生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將大鼠隨機分為對照(control組;對應(yīng)時間點注射等量0.9%氯化鈉溶液);CI-AKI模型(model,腹腔注射呋塞米10 mL/kg,30 min后尾靜脈注射碘佛醇10 mL/kg)組;雷帕霉素(RAPA;造模前灌胃注射RAPA 4.5 mg/kg)組和羥基氯喹(HCQ;造模前灌胃注射HCQ 20 mg/kg)組,每組均n=6,造模前每天給藥持續(xù)3 d。碘佛醇注射24 h后收集血清和腎臟樣本。Scr值在造影劑暴露后較基礎(chǔ)值增加≥25%視為造模成功[5]。

1.2.2 腎功能指標(biāo)的檢測:根據(jù)試劑盒的說明,檢測Scr及BUN的含量。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腎臟組織病理學(xué)變化: 將包埋腎臟組織的石蠟塊切成4 μm的切片,經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫水,HE染色,光學(xué)顯微鏡下(× 400)觀察腎臟組織病理學(xué)變化。

1.2.4 透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu):切取1 mm3腎皮質(zhì)新鮮組織小塊,經(jīng)常規(guī)固定和梯度乙醇脫水,環(huán)氧樹脂梯度滲透后包埋,切成60 nm厚的超薄切片。切片用3%醋酸鈾和2.7%檸檬酸鉛雙染,透射電鏡觀察自噬超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白質(zhì)表達: 取冷凍腎臟組織,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心15 min,BCA測定蛋白質(zhì)濃度。煮沸變性后電泳分離、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉4 h,加入稀釋濃度1∶1 000的一抗LC3、p62、HDAC4及β-actin,4 ℃孵育過夜。隔天,二抗孵育,ECL發(fā)光液顯影,采用Image J軟件進行半定量分析。

1.2.6 RT-qPCR檢測mRNA表達:用Trizol提取總RNA,按照cDNA合成試劑盒說明,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA加入SYBR Green Master mix探針行RT-qPCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對于GAPDH的表達水平,實驗重復(fù)3次。引物序列如下:HDAC4上游引物:5′-TTGGATGTCACAGACTCC GC-3′;HDAC4下游引物:5′-GATGGCGATGTGTAG AGGGG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中BUN及Scr含量的比較

與對照組相比,模型組中血血清BUN及血清Scr含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比,RAPA組中BUN及Scr含量明顯降低(P<0.01)(表1)。

表1 RAPA和HCQ對CI-AKI大鼠腎臟功能的影響Table 1 Effects of RAPA and HCQ on renal function

2.2 HE染色觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

對照組大鼠無明顯組織病理學(xué)變化,模型組大鼠表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)腫脹及排列紊亂,出現(xiàn)充血、空泡變性及炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)損傷;與模型組相比,RAPA組大鼠上述病理學(xué)損傷明顯改善,而HCQ組無明顯緩解(圖1)。

RAPA.rapamycin; HCQ, hydroxychloroquine; Black arrows indicates vacular degeneration, renal tubular swelling, congestion or inflammatory cell infiltration.圖1 RAPA和HCQ對CI-AKI大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響Fig 1 Effects of RAPA and HCQ on histopathology of kidney in CI-AKI rats(×400)

2.3 透射電鏡觀察大鼠自噬超微結(jié)構(gòu)

對照組線粒體形態(tài)良好,無明顯空泡,腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完好,幾乎沒有自噬小體或自噬溶酶體的出現(xiàn)。模型組出現(xiàn)部分線粒體及空泡化,可見部分自噬小體和自噬溶酶體。在RAPA組,自噬小體或自噬溶酶體的數(shù)量明顯增加(P<0.01)。 HCQ組中自噬小體或自噬溶酶體的形成受到抑制(P<0.01)(圖2)。

RAPA.rapamycin; HCQ.hydroxychloroquine; Red arrows indicated autophagosomes, autolysosomes or autophogic vacuoles;#P<0.01 compared with control group; *P<0.01 compared with model group.圖2 RAPA和HCQ對大鼠組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)的影響Fig 2 Effects of RAPA and HCQ on autophagy-related ultrastructure in rat tissues (×10 000)

2.4 腎臟組織自噬蛋白表達水平

相比較于對照組,模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達明顯增加(P<0.05),p62表達降低(P<0.01)。相比較于模型組,RAPA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達增加(P<0.05),p62表達明顯降低(P<0.01)。此外,HCQ進一步增加了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的蛋白表達(P<0.01)(圖3)。

RAPA.rapamycin; HCQ.hydroxychloroquine; #P<0.05, ##P<0.01 compared with control group;*P<0.05, **P<0.01 compared with model group.圖3 Western blot和RT-qPCR檢測腎臟組織中LC3及p62的表達Fig 3 Expression of LC3 and pP62 in renal tissues was detected by Western blot and

2.5 腎臟組織HDAC4蛋白和mRNA表達水平比較

模型組和HCQ組HDAC4蛋白表達顯著增加(P<0.01),而RAPA組HDAC4水平較模型組明顯降低(P<0.01),同樣地,與對照組相比,模型組及HCQ組中HDAC4 mRNA表達均有增加(P<0.01),RAPA組中HDAC4 mRNA表達明顯降低(P<0.05)(圖4)。

RAPA.rapamycin; HCQ.hydroxychloroquine; #P<0.01 compared with control group;*P<0.05, **P<0.01 compared with model group.圖4 Western blot和RT-qPCR檢測HDAC4蛋白和mRNA在腎臟組織中的表達Fig 4 Expression of HDAC4 protein and mRNA in renal tissues was detected by Western blot

3 討論

靜脈注射含碘造影劑(iodinated contrast media;CM)誘導(dǎo)的醫(yī)源性AKI稱之為CIN[6],它與住院患者死亡風(fēng)險的增加及潛在的慢性腎病(chronic kidney disease;CKD)的加速進展密切相關(guān)[7]。本研究使用造影劑碘佛醇建立CI-AKI大鼠模型,結(jié)果顯示造模后,血清中BUN、Scr的含量明顯增加并觀察到腎損傷(腎小管擴張、腫脹、壞死、管腔充血),提示造模成功。

自噬是真核細(xì)胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和更新的一種進化上保守的機制,參與了廣泛的生理病理過程,在腎臟疾病中扮演著重要角色[8]。在CIN病理狀態(tài)下,調(diào)節(jié)自噬被認(rèn)為是一種有效的治療策略[9]。有文獻報道,CM誘導(dǎo)的應(yīng)激條件可使腎臟自噬激活,αKlotho通過抑制AKT/mTOR信號通路進一步上調(diào)自噬水平可抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的焦亡,改善大鼠腎功能[10]。自噬標(biāo)記蛋白LC3是形成自噬小體的重要組成部分,無自噬時,LC3主要聚集于胞漿中,當(dāng)啟動自噬時, LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ定位于自噬體膜可與溶酶體結(jié)合,p62蛋白在自噬過程中先與泛素化蛋白結(jié)合,后與LC3Ⅱ蛋白形成復(fù)合物并被自噬溶酶體消除,通常p62蛋白水平增強表明自噬抑制。因此,本研究用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62活性衡量自噬水平。同報道一致,碘佛醇誘導(dǎo)的應(yīng)激可使暖臟自噬激活。自噬調(diào)節(jié)劑RAPA(自噬激動劑)和HCQ(自噬抑制劑)被應(yīng)用于干預(yù)CIN,在本研究中也發(fā)現(xiàn)RAPA通過進一步增強自噬可緩解CIN,而HCQ則加劇腎功能障礙和組織病理學(xué)損傷。上述研究表明,自噬在CI-AKI發(fā)生發(fā)展及治療中起著至關(guān)重要的作用。

HDAC4是Ⅱa類HDAC家族的重要成員,可以參與腎臟疾病中自噬的調(diào)節(jié)[11]。在葉酸和缺血/再灌注誘導(dǎo)的AKI中HDAC4的表達明顯增加,HDAC4選擇性抑制劑TMP269能夠有效促進細(xì)胞自噬,表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白表達增加[4]。同報道一致,模型組的大鼠表現(xiàn)為HDAC4表達的上調(diào)。另外,RAPA屬于一種特異性mTOR抑制劑。先前報道,α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate,AKG)可通過抑制mTOR通路增強自噬抑制HDAC4的表達來延緩衰老[12]。但也有報道自噬抑制劑氯喹(chloroguine,CQ)可抑制HDAC的活性[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)RAPA可抑制HDAC4的表達,而HCQ組中HDAC4表達明顯增加,表明在CI-AKI中自噬可調(diào)控HDAC4通路。

綜上所述,CI-AKI可介導(dǎo)自噬激活,啟動應(yīng)激后內(nèi)在保護機制。通過RAPA進一步激活自噬可有效減輕CI-AKI誘導(dǎo)的腎臟功能障礙,其機制可能與抑制mTOR后HDAC4的抑制相關(guān)。