蘇拾香，王語(yǔ)陽(yáng)，覃宗帥，黃桂香，徐 鍵，岑蘭英，覃月秋*

1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2.右江民族學(xué)院 研究生院，廣西 百色 533000

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病,以嚴(yán)重炎性反應(yīng)和腺泡細(xì)胞死亡為特征,該病起病急,進(jìn)展快,部分可發(fā)展為重癥急性胰腺炎,病死率高且預(yù)后差[1]。急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[2],而微RNA(microRNA,miRNA)可通過(guò)直接調(diào)控其靶基因影響細(xì)胞凋亡,參與急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展[3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡而參與胰腺損傷、炎性反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4]。研究發(fā)現(xiàn),miR-142-3p靶向Hmgb1在一些疾病中調(diào)控細(xì)胞凋亡[5],但在急性胰腺炎中尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞構(gòu)建AP模型,以研究miR-142-3p靶向Hmgb1調(diào)控腺泡細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制,為治療AP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

大鼠胰腺外分泌細(xì)胞系A(chǔ)R42J和Ham′s F-12K培養(yǎng)基(上海澳睿賽生物技術(shù)有限公司);PBS、多聚賴氨酸、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司);青-鏈霉素混合液、20×TBST、蛋白磷酸化酶抑制、PMSF、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司);雨蛙素(cerulein,純度≥95.0%,上海源葉生物科技有限公司);細(xì)胞凋亡-Hoechst 33258染色試劑盒、QuickBlockWestern快速封閉液、彩虹 Marker (上海碧云天生物技術(shù)有限公司);RIPA裂解液(北京英文特生物技術(shù)有限公司);Caspase-3、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP、山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP (江蘇親科生物研究中心有限公司);Bax、HMGB1抗體(Abcam公司);質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);Bcl-2、10×SDS-PAGE 電泳緩沖液、10×Tris-Glycine 轉(zhuǎn)膜緩沖液、PAGE 凝膠快速制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司);Trizol、 Lipofectamine3000(上海賽默飛世爾科技有限公司);PVDF 膜(Millpore公司);超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(蘇州莫納生物科技有限公司);Opti-MEM (Gibco公司);MicroRNA第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix擴(kuò)增試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);RT-qPCR 引物(廣州易錦生物技術(shù)有限公司);AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:將AR42J細(xì)胞分為空白組(blank),急性胰腺炎細(xì)胞模型組[6](AP,100 nmol/L雨蛙素作用24 h),造模24 h后細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。再分別用miR-142-3p mimics、 mimics NC、miR-142-3p inhibitor 和inhibitor NC轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞6～8 h,記為miR-142-3p mimics組、 mimics NC組、miR-142-3p inhibitor組 和inhibitor NC組,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后用于試驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-142-3p表達(dá):轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞加入1mL Trizol試劑提取細(xì)胞RNA,利用miRNA第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 10 s, 退火56 ℃ 10 s,延伸72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以U6作為 miR-142-3p的內(nèi)參,結(jié)果使用2-ΔΔCt法分析。各基因引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 Western blot檢測(cè)HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白:轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞,用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,收集上清液,用BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE分離條件為80 V 30 min,120 V 70 min,常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后,快速封閉液封閉45 min, 各組分別加入各兔抗人HMGB1抗體(1∶1 000)、兔抗人 caspase-3抗體(1∶1 000)、鼠抗人 Bcl-2 抗體(1∶1 000)、兔抗人β-actin 抗體(1∶5 000) 4 ℃搖床孵育過(guò)夜,洗滌,IgG-HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)二抗室溫?fù)u床孵育2 h,洗滌, ECL顯影。蛋白質(zhì)條帶使用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4 Hoechst染色測(cè)定細(xì)胞凋亡:各組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),使其約為50%～80%匯合度。刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5 mL固定液,固定10 min或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。去固定液,用PBS洗滌。加入0.5mL Hoechst 33258染色液染色。去染色液,用PBS洗滌。滴抗熒光淬滅封片液。熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率:轉(zhuǎn)染后24 h,制備各組重懸細(xì)胞,各組細(xì)胞按照annexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系:構(gòu)建Hmgb13′UTR-WT和Hmgb13′UTR-MUT的熒光素酶報(bào)告載體,分別與miR-142-3p mimics、miR-142-3p mimics NC共轉(zhuǎn)染,按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)操作,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,比較各組相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

常規(guī)培養(yǎng)的AR42J細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣,貼壁增殖,細(xì)胞增殖速度緩慢,有密度依賴,成片增殖(圖1A)。雨蛙素刺激造模24 h后,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,部分細(xì)胞變形,偽足增多(圖1B)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞松散,形態(tài)較圓,部分細(xì)胞可見(jiàn)脫落死亡(圖1C)。

A.normal AR42J cells; B.24 hours after cerulein stimulation,vacuoles appeared in the cytoplasm, cell deformation, pseudopodia increased(white arrow);C.24 hours after transfection,cells were loose and round in shape, and some cells fell off and died(white arrow)圖1 AR42J細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染效果Fig 1 Cell culture and transfection effect for AR42J cells(×200)

2.2 各組細(xì)胞miR-142-3p的表達(dá)

與空白組相比,AP組的miR-142-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01);與mimics NC組相比,miR-142-3p mimics組miR-142-3p表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組miR-142-3p表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

AP.acute pancreatitis; *P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC.圖2 各組細(xì)胞miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量Fig 2 Relative expression of miR-142-3p in each

2.3 各組細(xì)胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

與空白組相比,AP組的HMGB1、caspase-3蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)(圖3A～B),Bax蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)(圖3C),Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低 (P<0.01)(圖3D)。與mimics NC組相比,miR-142-3p mimics組HMGB、caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)(圖3A～C),Bcl-2蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)(圖3D)。與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組HMGB1、caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)(圖3A～C),Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)(圖3D)。

A.relative expression of HMGB1 protein in each group; B.relative expression of caspase-3 protein in each group; C.relative expression of Bax protein in each group; D.relative expression of Bcl-2 protein in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC group; AP.acute pancreatitis.圖3 各組細(xì)胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況Fig 3 Expression of HMGB1, caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in each

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況

空白組正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色(圖4A),與空白組相比,AP組細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染,部分顏色發(fā)白(圖4B);與mimics NC對(duì)照組相比,miR-142-3p mimics組細(xì)胞核致密濃染較少(圖4D);與inhibitor NC組相比轉(zhuǎn)染miR-142-3p inhibitor后細(xì)胞核致密濃染增多(圖4F)。二維散點(diǎn)圖記錄AR42J細(xì)胞凋亡, annexinV-APC為橫坐標(biāo), 7-AAD為縱坐標(biāo), 以陰性對(duì)照設(shè)定正常界限, 將細(xì)胞分為: 正?；罴?xì)胞(左下象限Q1-LL,annexinV-APC-、7-AAD-); 早期凋亡細(xì)胞(右下象限Q1-LR,annexin V-APC+、7-AAD-); 晚期凋亡和死亡細(xì)胞(右上象限Q1-UR,annexin V-APC+、7-AAD+)。與空白組相比,AP組早期凋亡細(xì)胞增多,凋亡率顯著升高(P<0.01)(圖5B);與mimics NC對(duì)照組相比,miR-142-3p mimics組早期細(xì)胞凋亡減少,凋亡率顯著降低(P<0.01)(圖5D);與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組早期細(xì)胞凋亡增多,凋亡率顯著升高(P<0.01)(圖5F)。

AP.acute pancreatitis;*P<0.01 compared with blank or NC.圖5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)各組AR42J細(xì)胞凋亡水平Fig 5 Level of apoptosis in each group of AR42J cells was detected by flow

2.5 miR-142-3p靶向調(diào)控Hmgb1的表達(dá)

Target Scan Human數(shù)據(jù)庫(kù)顯示HMGB1與hsa-miR-142-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hmgb1與miR-142-3p之間的互作關(guān)系,進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hmgb1與rno-miR-142-3p含有互補(bǔ)的核苷酸序列(圖7);與轉(zhuǎn)染miR-142-3p mimics NC+rno-Hmgb1-3′UTR-wt 相比,共轉(zhuǎn)染rno-miR-142-3p mimics+rno-Hmgb1-3′UTR-wt的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)。由此可見(jiàn),miR-142-3p可靶向調(diào)控Hmgb1的表達(dá)(圖8)。

圖6 Target Scan Human數(shù)據(jù)庫(kù)顯示HMGB1與miR-142-3p的互作靶點(diǎn)Fig 6 Target Scan Human database shows the interaction target of HMGB1 and miR-142-3p

圖7 Rno-miR-142-3p與r-Hmgb1-3′UTR靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖Fig 7 Binding of rno-miR-142-3p to rno-Hmgb1-3′UTR target site

3 討論

急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病, 起病急,進(jìn)展快, 大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕癥急性胰腺炎,呈自限性,但仍有20%發(fā)展為重癥急性胰腺炎[7]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與AP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2],在輕癥急性胰腺炎中存在廣泛的腺泡細(xì)胞凋亡,但在重癥急性胰腺炎中則以腺泡細(xì)胞壞死為主[8]。

HGMB1通常作為損傷相關(guān)模式分子,是炎性反應(yīng)、免疫和代謝反應(yīng)的介質(zhì)[9],近年研究發(fā)現(xiàn)HGMB1可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡而參與胰腺損傷、炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4]。經(jīng)雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠模型、AR42J細(xì)胞炎性模型中,HGMB1、caspase-3、Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低[10-11]。急性胰腺炎患者血清中caspase-3水平升高[12]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白組相比,模型組HGMB1、caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量升高,Bcl-2蛋白表達(dá)量下降,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

miR-142-3p作為一類小非編碼RNA,在機(jī)體生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[13]。研究發(fā)現(xiàn),miR-142 模擬物靶向 TLR4/NF-kB 信號(hào)通路,促進(jìn)Bcl-2表達(dá),抑制caspase-3和Bax表達(dá),從而抑制新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)小鼠心臟組織免受缺血/再灌注的侵害,從而改善心臟功能[14]。在實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)軟骨組織中,miR-142-3p表達(dá)水平下降,miR-142-3p的過(guò)表達(dá)靶向Hmgb1介導(dǎo)的 NF-kB 信號(hào)通路來(lái)抑制軟骨細(xì)胞凋亡[15]。

上述研究表明,miR-142-3p與細(xì)胞凋亡及疾病進(jìn)展密切相關(guān),但是否靶向Hmgb1調(diào)控雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠外分泌系細(xì)胞AR42J的凋亡尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在AP組中miR-142-3p低表達(dá),HGMB1、caspase-3、Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),細(xì)胞凋亡水平升高。上調(diào)miR-142-3p表達(dá)后,HGMB1、caspase-3、Bax表達(dá)下調(diào),Bcl-2表達(dá)上調(diào),細(xì)胞凋亡水平下降;而下調(diào)miR-142-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果。提示miR-142-3p可能通過(guò)HGMB1調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)來(lái)調(diào)控急性胰腺炎AR42J細(xì)胞的凋亡。為明確miR-142-3p與Hmgb1靶向關(guān)系,本研究進(jìn)行雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn),結(jié)果證實(shí)Hmgb1為miR-142-3p的靶基因。

綜上所述,miR-142-3p通過(guò)靶向Hmgb1調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平,進(jìn)而影響雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞系A(chǔ)R42J的凋亡,這為臨床治療AP提供新思路。