余 潔，馬明磊，張化冰，平 凡，李 偉，許嶺翎，李玉秀*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科 國家衛(wèi)生健康委員會內(nèi)分泌重點實驗室，北京 100730；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100038

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種高度惡性的腫瘤,90%的患者在被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在胰周和腹腔臟器,導(dǎo)致中晚期病情較為嚴(yán)重,預(yù)后非常不好[1]。

據(jù)流行病學(xué)研究顯示,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者的腫瘤發(fā)生更為普遍[2]。在糖尿病或糖尿病前期人群中,患胰腺癌的相對風(fēng)險在1.6至2.8之間[3]。一項薈萃分析表明,空腹血糖每升高0.56 mmol/L,患胰腺癌的風(fēng)險就會增加14%[4]。 二甲雙胍(metformin,Met)作為一種降糖藥物,近年來越來越多的研究證明它還具有抗腫瘤的潛能[5],然而,不同的葡萄糖水平是否會影響其抗腫瘤作用,結(jié)論尚不統(tǒng)一。此外,研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過調(diào)控微RNAs(microRNAs,miRNAs)表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[6],而一些研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p具有抑制細(xì)胞增殖的作用[7]。但是,二甲雙胍的抗腫瘤作用是否與miR-139-5p相關(guān)目前尚無研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)。

1.1.2 試劑(盒):EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒、TUNEL試劑盒、DAPI染色液(廣州銳博生物技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Qiagen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞:將細(xì)胞置于含有25 mmol/L葡萄糖[高糖(high-glucose,HG)組]或5 mmol/L葡萄糖[正常糖(normal-glucose,NG)組]+10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,并在含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別加入不同濃度的二甲雙胍(0、5、10、20 mmol/L)處理細(xì)胞48 h,對細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。重復(fù)樣本數(shù)n=3。

1.2.2 轉(zhuǎn)染siRNA:使用LipofectamineTM3000對細(xì)胞進(jìn)行miR-139-5p模擬物和陰性對照轉(zhuǎn)染。

1.2.3 EdU法檢測細(xì)胞增殖:取對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞,以5×107個/L細(xì)胞的濃度接種于96孔板中。24 h后,分別加入不同濃度的二甲雙胍(0、5、10、20 mmol/L)處理細(xì)胞48 h。接著,使用EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒來檢測細(xì)胞的增殖情況。通過使用Acumen X3細(xì)胞儀進(jìn)行圖像采集,并且用增殖細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)計算出細(xì)胞增殖率。

1.2.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡:取對數(shù)期的PANC-1細(xì)胞,以5×107個/L的濃度在96孔板中接種。24 h后,分別加或不加二甲雙胍(0/5/10/20 mmol/L)處理48 h。采用TUNEL試劑盒鑒定凋亡細(xì)胞中的DNA片段。用Acumen X3細(xì)胞儀進(jìn)行圖像采集,用凋亡細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移:將對數(shù)生長的PANC-1細(xì)胞以濃度5×107個/L接種在帶有OrisTM細(xì)胞接種限位塞的96孔板(Platypus Technologies)中。利用OrisTM塞子工具謹(jǐn)慎移除硅膠塞子,在板中心創(chuàng)建了一個大約2 mm直徑的無細(xì)胞區(qū)。經(jīng)過48 h的二甲雙胍(濃度為0/5/10/20 mmol/L)處理,使用DAPI染色,Acumen X3細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。中心的無細(xì)胞區(qū)域?qū)⒈粡闹苓厖^(qū)域遷移過來的細(xì)胞所填充,體現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力。

1.2.6 細(xì)胞周期的檢測:將對數(shù)期的PANC-1細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化,調(diào)整到濃度為5×107個/L,接種在96孔板中。進(jìn)行二甲雙胍處理(濃度分別為0/5/10/20 mmol/L),持續(xù)48 h。使用DAPI染色法來檢測細(xì)胞的周期,并通過Acumen X3細(xì)胞儀來分析并計算出處于各個細(xì)胞周期的細(xì)胞的比例。

1.2.7 RT-qPCR定量檢測miR-139-5p的表達(dá):使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成,利用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測。選擇小RNAU6作為內(nèi)參,引物序列如下:miR-139-5p(forward primer):5′-AATAGTAGCCCCTGCCCACC-3′,U6(forward primer):5′-AATAGTAGCCCCTGCCCACC-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍可抑制PANC-1細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)S期和G2/M期阻滯

PANC-1細(xì)胞在NG和HG培養(yǎng)環(huán)境下,5 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍均能抑制其生長(P<0.05)(圖1A),10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍均能促進(jìn)其凋亡(P<0.01)(圖1B),這種作用在NG培養(yǎng)條件下更為顯著,高劑量的二甲雙胍(10或20 mmol/L)幾乎能完全抑制PANC-1細(xì)胞的生長,并能導(dǎo)致80%～95%的細(xì)胞凋亡(P<0.001)(圖1D～E,G)。然而,僅在HG培養(yǎng)條件下中,10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍可抑制PANC-1細(xì)胞的遷移(P<0.05)(圖1C,H)。

A,B.cell proliferation;C,D.cell apoptosis;E,F.cell migration;G.identification of DNA fragments in apoptosis cells using TUNEL kit;H.cell migration test:Green fluorescence in the central area represented migrating cells, while blue fluorescence in the peripheral area represented non-migrating cells;Met.metformin; NG.normal-glucose; HG.high-glucose group;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Met 0 mmol/L;#P<0.01 compared with HG.圖1 二甲雙胍對人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響Fig 1 Effects of metformin on proliferation, apoptosis and migration of PANC-1

在HG組中,10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍能降低G1期細(xì)胞的比例,提高S期和G2/M期細(xì)胞的比例(P<0.05)(圖2A);在NG組中,5 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍能降低G1期細(xì)胞的比例,提高S期和G2/M期細(xì)胞的比例(P<0.05)(圖2B)。二甲雙胍對PANC-1細(xì)胞周期的作用在NG組比HG組更為顯著(P<0.05)(圖2C～F)。

A.effects of metformin on cell cycle in high-glucose(HG) group;B.effects of metformin on cell cycle in normal-glucose(NG) group;C.percentage of G1 phase cells;D.percentage of S phase cells;E. percentage of G2/M phase cells;F.percentage of S+G2/M phase cells;Met.metformin; *P<0.05 compared with Met 0 mmol/L; #P<0.05, ###P<0.001 compared with HG.圖2 二甲雙胍對PANC-1細(xì)胞周期的影響Fig 2 Effects of metformin on cell cycle of

2.2 正常糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍干預(yù)上調(diào)PANC-1細(xì)胞中miR-139-5p表達(dá)

在無二甲雙胍處理下,高糖組和正常糖組中的miR-139-5p表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在二甲雙胍處理后,正常糖組中的miR-139-5p表達(dá)量上調(diào),高糖組中的變化則無統(tǒng)計學(xué)意義,其中5 mmol/L和10 mmol/L的二甲雙胍處理分別使正常糖培養(yǎng)條件下的PANC-1細(xì)胞中miR-139-5p表達(dá)量增加了0.97倍和0.72倍(圖3A,B)。

A.effects of different concentrations of metformin on the expression of miR-139-5p in PANC-1 cells; B.expression of miR-139-5p in PANC-1 cells under different concentrations of glucose culture conditions; NG:normal-glucose group;HG.high-glucose group;Met.metformin; *P<0.001 compared with Met 0 mmol/L;#P<0.01 compared with HG.圖3 不同葡萄糖培養(yǎng)條件下miR-139-5p在二甲雙胍干預(yù)前后的表達(dá)差異Fig 3 Expression of miR-139-5p in different glucose culture conditions before and after metformin

2.3 正常糖培養(yǎng)條件下,miR-139-5p可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用

在無二甲雙胍干預(yù)且處于正常糖培養(yǎng)條件下,相較于NC組,miR-139-5p模擬物組的PANC-1細(xì)胞增殖下降,凋亡增加但未達(dá)統(tǒng)計學(xué)差異,細(xì)胞周期無影響。高糖培養(yǎng)條件下,兩組之間的上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A,C;圖5A,C,E)。

A,B.cell proliferation;C,D.cell apoptosis; NC.negative control;Met.metformin;NG.normal-glucose group; HG.high-glucose group; *P<0.05,**P<0.001 compared with NC;#P<0.05,##P<0.001 compared with HG.圖4 miR-139-5p模擬物對高糖或正常糖條件下培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 4 Effects of miR-139-5p mimic on proliferation and apoptosis of PANC-1 cells cultured under high or normal glucose

A,B.percentage of G1 phase cells;C,D.percentage of S phase cells;E,F.percentage of G2/M phase cells;NC.negative control;Met. metformin,;NG.normal-glucose group;HG.high-glucose group; *P<0.05 compared with NC; #P<0.001 compared with HG.圖5 miR-139-5p模擬物對高糖和正常糖條件下培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞周期的影響Fig 5 Effects of miR-139-5p mimic on the cell cycle of PANC-1 cultured under high and normal glucose

二甲雙胍干預(yù)+正常糖培養(yǎng)條件下,miR-139-5p模擬物組與NC組相比,5 mmol/L二甲雙胍抑制增殖作用增強,10 mmol/L二甲雙胍促進(jìn)凋亡作用增強,10 mmol/L二甲雙胍對細(xì)胞S期阻滯的作用減弱(P<0.01),而在高糖組miR-139-5p模擬物對二甲雙胍的作用影響無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A,C;圖5A,C,E)。

無論是否存在二甲雙胍的干預(yù),相較于高糖組,miR-139-5p模擬物在正常糖組中對細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用表現(xiàn)得更為顯著,使正常糖組中的PANC-1細(xì)胞具有更低的G1期比例和更高的S期以及G2/M期比例(圖4B,D;5B,D,F)。

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并促使細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期。在正常糖培養(yǎng)條件下,這些作用更為顯著。另外,只有在正常糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍處理的PANC-1細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)增加,miR-139-5p模擬物可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用。

既往研究已證實二甲雙胍具有抗腫瘤作用,且在多種腫瘤相關(guān)研究中得到證實。然而,關(guān)于不同的葡萄糖培養(yǎng)濃度對二甲雙胍作用的影響,研究結(jié)論仍不一致。部分研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍僅在正常葡萄糖培養(yǎng)條件下抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8-9];另一研究則發(fā)現(xiàn),在高葡萄糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍能抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖,但在正常葡萄糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍能夠促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡[10],部分支持該研究結(jié)果?？赡艿臋C制是僅在正常糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬[10],并可通過抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ATP進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。此外,該研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍僅在正常糖培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞中miR-139-5p表達(dá)上調(diào),且miR-139-5p可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用,提示miR-139-5p表達(dá)上調(diào)可能也是二甲雙胍在正常糖培養(yǎng)條件下抗腫瘤作用更強的重要機制之一。因此,相對較低的血糖水平可能可以提高腫瘤細(xì)胞對二甲雙胍抗腫瘤作用的敏感性,提示糖尿病合并胰腺癌患者應(yīng)積極進(jìn)行降血糖治療。

其次,既往的研究顯示二甲雙胍可以使某些腫瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期,但本研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍導(dǎo)致PANC-1細(xì)胞停滯在S期和G2/M期,這與之前的一些研究結(jié)果不一致[12-13]。這種差異可能與二甲雙胍的干預(yù)時長有關(guān),在此前的研究中,二甲雙胍的使用時間從24到72 h不等。另外,吉西他濱是一種通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯來發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物[14],被視為胰腺癌的一線化療藥物。體內(nèi)外的研究顯示,二甲雙胍與吉西他濱聯(lián)合可增強吉西他濱單獨使用的效果[15]。因此,二甲雙胍與吉西他濱或其他針對細(xì)胞周期S期或G2/M期的藥物聯(lián)合使用可能具有協(xié)同增強的抗腫瘤效果,有望給患者帶來更多的獲益。

本研究存在一些局限性,包括:1)未通過沉默miR-139-5p來進(jìn)行反向驗證,以雙向確認(rèn)其作用;2)未進(jìn)行有或無糖尿病的腫瘤誘導(dǎo)小鼠實驗。

綜上,在正常糖培養(yǎng)條件下,二甲雙胍抑制PANC-1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用較高糖培養(yǎng)條件下更顯著,部分可能與上調(diào)miR-139-5p有關(guān)。未來還需進(jìn)行更多的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)一步證實。