田林

西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850000

錫金海棠Malus sikkimensis(Wenz.) Koehne 為薔薇科蘋果屬植物，生于2500～3000 米的山坡疏林及河谷混交林中，國內(nèi)主要分布在西藏南部及東南部、云南西北部［1］。西藏南部高寒偏遠地區(qū)民眾將錫金海棠葉片干燥制成熱飲替代茶葉制飲品使用的歷史悠久。人們采集地上枯葉做茶，屬于小眾且原始使用，又僅在該區(qū)域應(yīng)用，缺少有效開發(fā)。

在泛喜馬拉雅地區(qū)有許多野生的蘋果屬植物資源，多數(shù)研究集中在其園藝和作為蘋果砧木價值［2］。

據(jù)現(xiàn)有文獻和蘋果屬植物長期的研究表明，其葉子具有一定的保健作用，例如湖北海棠M.hupehensis（Pamp.）Rehd.嫩葉經(jīng)過茶工藝可制成飲用茶，俗稱三皮罐，其具有消食化積等作用［3，4］；山荊子M.baccata(L.)Borkh.葉子經(jīng)過加工處理后具有減肥功效［5，6］；光葉隴東海棠M.kansuensis f.Calva 的葉經(jīng)過提取加工，具有消炎、解毒等作用［7］。蘋果屬植物中含有多種化合物，目前國內(nèi)外研究人員對其已經(jīng)分離提取出酚類、萜類、生物堿以及其它化合物，其葉片主要含有多酚類和黃酮類，具有抗氧化延緩衰老、維持體內(nèi)激素平衡、改善睡眠、減肥瘦身、降糖調(diào)脂等作用［8-11］。

本實驗嘗試利用LTQ-Orbitrap/MS/MS 進行正、負離子模式采集數(shù)據(jù)，通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，將實驗結(jié)果和建立的錫金海棠數(shù)據(jù)庫、錫金海棠數(shù)據(jù)庫和茶葉數(shù)據(jù)庫進行比對，分析其化學(xué)成分；對錫金海棠茶葉水提物基于脂肪酶和α-糖苷酶抑制活性進行減肥降脂功效評價，以期對當?shù)厝罕娬J為具有減肥降脂的功效進行論證，為錫金海棠在西藏自治區(qū)邊疆偏遠、高寒地區(qū)作為代茶葉資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

LTQ Orbitrap XL Domain35A 高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀（Theromo Fisher）；高速多功能目粉碎機（50-800 目）（萊芙）；GL-16B 高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；分析天平（1/10000）（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；KQ320 0DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）。α-葡萄糖苷酶、豬胰脂肪酶、苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖、奧利司他、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等均為分析純。

干燥的錫金海棠莖葉采自西藏自治區(qū)山南市洛扎縣，由西藏自治區(qū)科技廳赤來旺杰提供，西藏自治區(qū)高原生物研究所馬超副研究員鑒定。

2 試驗方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 錫金海棠粉末制備。將錫金海棠干燥的葉片放入粉碎機中進行粉碎，粉碎時間3 分鐘，過200 目篩，得到錫金海棠粉末。

2.1.2 錫金海棠上清液制備。精密稱取0.1g 錫金海棠粉末，裝入10mLEP管中加入50%甲醇水溶液5mL，將EP 管放置在超聲波清洗器中進行超聲提取45min，溫度40℃，功率100W，使錫金海棠進一步溶解在甲醇水溶液中。取液上清液2mL 置于EP 管，放入離心機中離心15min，轉(zhuǎn)速13000rpm，取500μL 過0.3μm 有機相濾膜裝入棕色細口瓶中，得到錫金海棠上清液。

2.1.3 錫金海棠浸膏制備。錫金海棠粉末未過篩300g 超純水煮沸浸提三次（海拔3680m，沸點89℃），得到粗提物浸膏?？偨嘤贸兯稚ⅲ缓蠓謩e用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，接著減壓濃縮，回收相應(yīng)的溶劑，最后得到不同部位的萃取物。

2.2 液相及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件。色譜柱為C18(1.8μm，2.1×100mm）；柱溫30℃；流速0.30mL/min；進樣量2μL；流動相采用甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)溶液進行梯度洗脫，洗脫程序: 0～10 min,5%～25% A;10～30 min，25%～75% A；30～35 min，75%～95%A；35～40min，5%A。

2.2.2 質(zhì)譜條件。采用HESI 離子源,溫度為600℃，正、負離子模式檢測,正離子檢測模式,噴霧電壓:+5500 V;負離子檢測模式,噴霧電壓:-4500 V，霧化氣體為氮氣，去簇電壓分別為100 V，碰撞能量分別為35 eV，碰撞能量擴展分別為15eV，掃描范圍:m/z 50～1500。

2.3 建立錫金海棠主要成分數(shù)據(jù)庫

通過文獻檢索匯總錫金海棠、薔薇科蘋果屬子類和茶葉相關(guān)的主要化學(xué)成分，包括通過知網(wǎng)及PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）等數(shù)據(jù)庫。對數(shù)據(jù)庫中的成分進行匹配注釋，準確獲得一級、二級代謝物的離子信息，根據(jù)獲得的信息建茶葉主要成分數(shù)據(jù)庫和錫金海棠成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。成分鑒定完成后進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比（Δppm＜10），再和MS/MS 模式所得碎片離子自建庫進行比對確認，最后利用TraceFinder4.1 General Quan進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理。

2.4 降脂減肥功效

錫金海棠水提浸膏、乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及最后水溶部分分別檢測脂肪酶及α 糖苷酶抑制活性。

2.4.1 胰脂肪酶活性檢測。參考李鑫鑫等［12］的方法，25μL 待測溶液與25μL 胰脂肪酶溶液（0.5 mg/mL）在96 孔微量滴定板中混合均勻，37°C 孵育10 min，加入50 μL 4-甲基傘形酮油酸酯（0.5 mg/mL），混勻，37°C反應(yīng)30min，熒光酶標儀（Em/Ex=465/360）在37℃下測量4-甲基傘形酮的熒光值。奧利司他作為陽性對照，胰脂肪酶抑制率的計算公式見式（1）。

式中：AX為加入抑制劑的值，AX0為樣品的背景值，A0為酶溶液的背景值。

2.4.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制檢測。參考Miao 等［13］的方法，10μL 待測溶液與4μLα-葡萄糖苷酶溶液混合，加入200μL0.1 M 磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)溶液，37℃孵育10 分鐘，再加入10μL pNPG 溶液（20mM），然后將混合物在37℃溫育40 分鐘，加入200μL 碳酸鈉終止反應(yīng)，冷卻至室溫，于405nm 波長處測定吸光度。以阿卡波糖為陽性對照，α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式見式（2）。

式中：Ax為樣品吸光度；A0為空白吸光度。

3 結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

3.1 錫金海棠化學(xué)成分

通過文獻整理，建立錫金海棠化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫和茶葉化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫，分別收錄102、103種化合物，將錫金海棠上清液正、負離子與錫金海棠數(shù)據(jù)庫對比分析出匹配度較高的36 種化合物（見表1），與茶葉數(shù)據(jù)庫對比分析出匹配度較高的15 種化合物（見表2）。錫金海棠提取上清液正、負離子模式下總離子流圖（見圖1、2）。

圖1 錫金海棠正離子

圖2 錫金海棠負離子圖

表1 錫金海棠上清液與錫金海棠數(shù)據(jù)庫對比分析

3.2 功能檢測

錫金海棠總提取物及不同溶劑萃取物對胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性見表3，錫金海棠總提取物和乙酸乙酯萃取物對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制活性，但明顯低于陽性對照，而正丁醇萃取物和水萃取物只抑制α-葡萄糖苷酶活性。因而錫金海棠胰脂肪酶抑制活性可忽略不計，對α-葡萄糖苷酶有一定抑制活性。

表3 錫金海棠提取物及不同溶劑萃取物對胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性

4 討論

錫金海棠茶在我國西藏南部具有較高的經(jīng)濟價值，本研究從錫金海棠葉中檢測出萜類、多酚類、黃酮類、生物堿、有機酸、維生素等成分，通過查閱文獻，以上成分與大多數(shù)薔薇科蘋果屬的植物一樣，且在茶葉中也能找到相似或相同的成分，這也是錫金海棠葉在我國一些高寒(云南西北部、西藏等地)不適宜種植茶葉的地區(qū)被當作茶葉替代品的原因。同時，實驗證實了錫金海棠能夠抑制α-糖苷酶活性，具有一定的減肥降脂功效，錫金海棠中的原花青素B2 具有抗氧化的作用；其中鑒定出的茶葉干物質(zhì)占比高的成分兒茶素具有延緩衰老、調(diào)理腸道的作用。

在西藏南部當?shù)鼐用癜彦a金海棠作為一種代茶資源，具有較高的經(jīng)濟價值，與采集鮮葉不同，當?shù)匕傩帐占匀宦淙~作為代茶飲，由于特殊的口感，當?shù)厝藗冇幸欢ǖ钠?，自然落葉由于自然發(fā)酵或者腐爛等因素，其產(chǎn)品的質(zhì)量和衛(wèi)生狀況較難控制。同時錫金海棠屬于狹域分布的物種，在1999 年8 月4 日發(fā)布的《中國國家重點保護野生植物》（第一批）中被列為Ⅱ級瀕危，2021年中國國家林業(yè)局和農(nóng)業(yè)部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《國家重點保護野生植物名錄》中再次列為二級瀕危野生植物，IUCN（國際自然保護聯(lián)盟）將其評為易危物種（VU）。因此，錫金海棠茶資源開發(fā)應(yīng)建立嚴格的行政管理體系，同時須建立人工繁育種植體系，降低對自然資源的依賴，避免盲目開發(fā)帶來的資源破壞。本文為錫金海棠特色茶飲資源開發(fā)提供依據(jù)，以期對邊疆地區(qū)助力富民興邊有一定現(xiàn)實意義。