邢常瑞, 鄭 欣, 董 雪, 李光磊, 劉崇靖,張 勛,2, 袁 建, 鞠興榮

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心;江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1,南京 210023)

(山東美正生物科技有限公司2,日照 102100)

玉米是生物經(jīng)濟(jì)的基本原料,用途十分廣泛,自2012年以來(lái)超過(guò)稻谷成為我國(guó)第一大糧食作物,其產(chǎn)業(yè)鏈和價(jià)值鏈不斷增長(zhǎng)和擴(kuò)張。然而,玉米在田間收獲、干燥、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏等多個(gè)環(huán)節(jié)中都易受到真菌的污染而導(dǎo)致黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮毒素等多種真菌毒素危害[1],影響以玉米為原料的相關(guān)食品的質(zhì)量,對(duì)居民身體健康造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明谷物中真菌毒素的混合污染對(duì)生物體造成的危害情況更為復(fù)雜,風(fēng)險(xiǎn)更大[2],當(dāng)多種真菌毒素同時(shí)存在時(shí),他們之間可能發(fā)生拮抗或協(xié)同作用,將對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生不同程度的負(fù)面影響。目前在細(xì)胞水平有證據(jù)表明毒素共存會(huì)導(dǎo)致不同的聯(lián)合毒性。比如James等[3]研究表明DON和ZEN共存時(shí)在細(xì)胞毒性和DNA斷裂方面呈現(xiàn)加和作用,在DNA合成方面呈現(xiàn)亞加性作用,在脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)方面呈現(xiàn)協(xié)同作用。2018—2020年間來(lái)自歐洲、非洲、亞洲和南美洲的超過(guò)1 000份玉米樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,75%的樣品受到了多重毒素的污染[4]。一項(xiàng)針對(duì)廣西省百色市玉米真菌毒素污染狀況的調(diào)查表明,收集自2017—2019年間的玉米樣品中AFB1、DON和ZEN的檢出率分別為91.94%、5.38%和45.16%;其中,AFB1和ZEN超標(biāo)率為68.28%和22.04%[5]。玉米中真菌毒素的多重污染在糧食收儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中備受關(guān)注,在極端天氣條件下情況更為嚴(yán)重。

目前,糧食中真菌毒素的檢測(cè)方法有液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、免疫學(xué)檢測(cè)方法和電化學(xué)檢測(cè)方法等。LC和LC-MS/MS方法可以對(duì)多種目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè),靈敏度較高,適用于多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)[6]。然而,儀器檢測(cè)方法價(jià)格昂貴,場(chǎng)所受限,且需要熟練的操作人員,不適合用于糧食收獲及收購(gòu)現(xiàn)場(chǎng)多毒素的快速篩查。近年來(lái),單一真菌毒素的免疫層析試紙條(ICA)由于其特異性好、準(zhǔn)確度高、使用簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、易于推廣等特點(diǎn)得到了廣泛應(yīng)用[7, 8],因此,將ICA應(yīng)用于多種真菌毒素的檢測(cè)開(kāi)始受到人們的關(guān)注并具有極大的推廣價(jià)值[9-11]。目前,由于合成方法簡(jiǎn)單、可視化判斷方便、標(biāo)記方法成熟,膠體金是免疫試紙條中使用較多的信號(hào)材料。黃馨雨[12]利用膠體金作為免疫標(biāo)記物制備可同時(shí)檢測(cè)FB1和DON的免疫層析試紙條。Kong等[13]利用抗體的交叉性能,可以通過(guò)多線檢測(cè)試紙條方法實(shí)現(xiàn)20種真菌毒素的半定量和定量檢測(cè),Liu等[14]建立了基于手機(jī)雙模檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)谷物中多種真菌毒素膠體金和熒光雙模檢測(cè)。因此,建立快速、高通量、高靈敏度的多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法,用于糧食加工與收儲(chǔ)相關(guān)企業(yè)現(xiàn)場(chǎng)篩查具有十分重要的意義。

本研究?jī)?yōu)化了玉米中的多種毒素同時(shí)提取前處理方法,建立一種同步快速檢測(cè)玉米基質(zhì)中5種真菌毒素膠體金多檢測(cè)線試紙條,該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,檢測(cè)快速和成本較低等優(yōu)點(diǎn),可以在糧食倉(cāng)儲(chǔ)和加工企業(yè)中進(jìn)行推廣和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)和T-2毒素(T-2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液,單克隆抗體(anti-AFB1antibody、anti-FB1antibody、anti-T-2 antibody、anti-DON antibody和anti-ZEN antibody),包被抗原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA)和羊抗鼠IgG (H+L)。

1.2 儀器設(shè)備

HM 3030三維劃膜噴金,ZQ 2002微電腦自動(dòng)斬切機(jī),真空冷凍干燥機(jī),高速離心機(jī),Xevo TQ液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 膠體金免疫層析試紙條方法的建立

1.3.1 單克隆抗體標(biāo)記金納米粒子的制備

取50 mL離心管加入10 mL金溶液,再加入一定量的0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)合適的pH,蓋緊蓋子后用手輕輕搖晃至均勻。分別將5種真菌毒素的單克隆抗體,用0.002 mol/L的pH 8.0硼酸鹽緩沖液(BB)稀釋到0.2 mg/mL,分別加入一定量的抗體溶液,將各個(gè)混合物在25 ℃下恒溫振蕩(500 r/min)1 h后,加入2 mL 10% BSA封閉,室溫振蕩2 h(500 r/min)。以10 000 r/min離心30 min,去除上清液,將沉淀物溶解在2 mL金標(biāo)懸浮液中。根據(jù)流程分別制備AuNPs-AFB1mAb、AuNPs- FB1mAb、AuNPs- T-2 mAb、AuNPs- DON mAb和AuNPs- ZEN mAb的金標(biāo)抗體,并分別以每孔50 μL將其轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中,真空冷凍干燥后密封以防受潮[15]。

1.3.2 多檢測(cè)線免疫膠體金試紙條的制備

將NC膜、樣品墊和吸收墊逐層粘貼在PVC板上,制備免疫層析試紙條。硝酸纖維素膜貼在 PVC底板中部,吸水墊和樣品墊分別貼在PVC底板的上下兩端,并且與硝酸纖維素膜有1.5 mm左右的重疊。使用劃膜噴金儀,以1.0 μL /cm的速率分別將抗原AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠二抗噴到硝酸纖維素膜表面形成測(cè)試線(T-1線、T-2線、T-3線、T-4線和T-5線)和控制線(C線),每條線之間的距離為3 mm,將組裝好的卡片置于37 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h。組裝好的卡片烘干后用微電腦自動(dòng)斬切機(jī)切成3.8 mm寬的條狀,裝于塑封袋中,放入干燥柜中保存。

1.3.3 玉米樣品中真菌毒素前處理?xiàng)l件優(yōu)化

首先確定玉米樣品中5種真菌毒素同時(shí)提取條件參數(shù),并對(duì)提取溶劑的組分進(jìn)行了優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取1 g(精確到0.01 g)空白玉米樣品于10 mL離心管,加入4 mL提取溶劑(V乙腈∶V水∶V甲酸=70∶29∶1),渦旋提取20 min,然后以6 000 r/min離心10 min,吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中,加入0.5 mL水并渦旋混勻,在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,上清液過(guò)0.2 μm的有機(jī)相濾膜,收集濾液于進(jìn)樣瓶中。將5種毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白的玉米樣品提取液中,制備一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)將空白玉米樣品提取液作為對(duì)照。

本實(shí)驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液和含體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液作為提取溶劑。稱取8組1 g玉米陰性質(zhì)控樣品,每組包含3個(gè)平行,分別添加一定濃度的5種真菌毒素的混合溶液,按照以上處理步驟進(jìn)行處理后通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀器進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算不同提取溶劑的提取率,確定最佳提取溶劑。

1.3.4 膠體金試紙條測(cè)定玉米中的真菌毒素

首先,在陰性玉米粉樣品中加入一系列濃度的真菌毒素溶液制備基質(zhì)添加樣品。玉米粉中添加AFB1終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/kg,FB1終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0、1 000.0、2 000.0 μg/kg,T-2終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg,DON終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、40.0、80.0、200.0、400.0、800.0、2 000.0、4 000.0 μg/kg,ZEN終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg。

選擇優(yōu)化后的提取溶劑對(duì)玉米樣品中的五種真菌毒素進(jìn)行提取,并通過(guò)多重免疫膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)。分別稱取玉米粉1.0 g,按不同濃度進(jìn)行加標(biāo)后,加入4 mL乙腈-水(體積比為90∶10)溶液,快速振蕩1 min后,渦旋混勻20 min。6 000 r/min離心5 min后,將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中備用。分別取1 mL上清液加入10 mL離心管中,在氮?dú)饬飨麓蹈?以消除有機(jī)試劑對(duì)試紙條顯色的影響,最后加入5 mL PBST溶解樣品。溶液中AFB1的質(zhì)量濃度為 0.0、0.4、0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 ng/mL,FB1的質(zhì)量濃度為0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL,T-2的質(zhì)量濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL,DON質(zhì)量濃度為0.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0 ng/mL,ZEN的質(zhì)量濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL。

分別取150 μL樣品溶液加入含有5種真菌毒素金標(biāo)抗體的微孔中,室溫反應(yīng)15 min。試紙條檢測(cè)結(jié)果通過(guò)手機(jī)拍攝記錄檢測(cè)結(jié)果并通過(guò)肉眼判斷消線值(Cut off Value,免疫層析試紙條T線顯色完全消失時(shí)對(duì)應(yīng)真菌毒素的濃度值)。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)5條檢測(cè)線的灰度條帶進(jìn)行自動(dòng)提取,并計(jì)算峰面積,以加標(biāo)濃度和檢測(cè)線的峰面積建立5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算最低檢測(cè)限。

1.4 應(yīng)用多重膠體金試紙條快速同步檢測(cè)玉米樣品中的真菌毒素

利用所制備的膠體金試紙條對(duì)含有真菌毒素污染的玉米實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼判斷,并結(jié)合Image J對(duì)樣品進(jìn)行定量判定。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素前處理方法優(yōu)化

2.1.1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將5種毒素(AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN)混合的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白玉米樣品提取液中,并稀釋成一系列濃度梯度,同時(shí)將空白玉米樣品提取液作為陰性對(duì)照,液質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果表明5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998,線性關(guān)系良好。

表1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的線性關(guān)系及檢測(cè)限

2.1.2 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素前處理優(yōu)化

選擇(添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸)8種不同的乙腈水溶液提取溶劑,渦旋20 min,比較不同提取溶劑下的5種真菌毒素的添加回收率,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 玉米基質(zhì)中樣品提取溶劑的優(yōu)化

從圖1中可以看出,提取溶劑不同,同種真菌毒素的提取效率存在差異;相同提取溶劑對(duì)于每種真菌毒素提取效率也不同。對(duì)于AFB1,添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的70%、80%乙腈水溶液的回收率高于未添加甲酸的同等乙腈濃度的提取溶劑,而添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的60%乙腈水溶液的ZEN回收率高于未添加甲酸的60%乙腈水溶液。AFB1,FB1和T-2毒素在提取液為90%乙腈水溶液時(shí),回收率最高;DON在提取溶劑為80%乙腈水溶液時(shí)回收率最高,其次為體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液;ZEN在提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液和添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的乙腈水溶液時(shí),回收率相當(dāng)?？紤]這5種真菌毒素的提取效率,選擇體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈-水溶液作為玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的最佳提取溶劑。

2.1.3 玉米樣品添加回收實(shí)驗(yàn)

分別向玉米陰性樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的5種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,AFB1/FB1/T-2/DON/ZEN加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1/5/5/50/5、2/20/20/200/20、4/40/40/400/40 μg/kg。按照優(yōu)化的提取條件處理樣品,每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次(n=3),并計(jì)算玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。玉米基質(zhì)中低、中、高3個(gè)濃度添加水平的加標(biāo)回收率AFB1為99.3%～113.3%,FB1為100.5%～103.4%,T-2為71.9%～81.1%,DON為73.4%～87.6%,ZEN為106.9%～111.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～7.5%之間,表明該方法回收率高、準(zhǔn)確度較好。

因此,本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的提取方法適用于玉米樣品中5種真菌毒素的同時(shí)提取,并用于后續(xù)膠體金試紙條玉米樣品的前處理。

2.2 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素多重檢測(cè)膠體金試紙條方法的建立

當(dāng)150 μL含有高濃度目標(biāo)毒素的溶液添加到微孔,目標(biāo)物(AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN或全部毒素)與對(duì)應(yīng)毒素金標(biāo)抗體特異性結(jié)合,形成金標(biāo)抗體-毒素復(fù)合物。然后,將組裝好的免疫層析試紙條插入微孔中,5種毒素的金標(biāo)抗體-目標(biāo)毒素復(fù)合物從樣品墊端向吸水墊端移動(dòng)。在向上遷移的過(guò)程中,被結(jié)合的金標(biāo)抗體不會(huì)與固定在硝酸纖維素膜T線上的包被原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA和ZEN-BSA)發(fā)生特異性結(jié)合,T線不顯色;而金標(biāo)抗體-目標(biāo)毒素復(fù)合物將與羊抗鼠二抗IgG發(fā)生反應(yīng),C線顯色。當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)物或者濃度非常低時(shí),大部分的金標(biāo)抗體處于游離狀態(tài),在自下而上流經(jīng)硝酸纖維素膜,與T線上的各毒素包被原發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng),形成金標(biāo)抗體-毒素包被原復(fù)合物,而多余的金標(biāo)抗體將被控制線上的羊抗鼠二抗IgG結(jié)合,從而在T線和C線位置上顯示出明顯的紅色條帶。待測(cè)樣品中目標(biāo)毒素的含量與T線條帶的顯色值呈反比例關(guān)系。

玉米基質(zhì)中5種真菌毒素多重檢測(cè)膠體金試紙條實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)檢測(cè)溶液中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.0、50.0、5.0、20.0、10.0 ng/mL時(shí),T線顏色基本完全消失。根據(jù)樣品提取稀釋倍數(shù)換算,相當(dāng)于玉米樣品中同時(shí)含有AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80.0、1 000.0、100.0、400.0、200.0 μg/kg時(shí),免疫膠體金試紙條上的5條檢測(cè)線顏色基本完全消失。

圖2 膠體金免疫層析試紙條同步檢測(cè)玉米基質(zhì)中5種不同濃度的真菌毒素

使用Image J提取多重檢測(cè)試紙條檢測(cè)線的灰度面積,根據(jù)檢測(cè)樣品溶液濃度和對(duì)應(yīng)的面積建立玉米基質(zhì)中五種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)玉米樣品中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的值分別為8.0、20.0、10.0、40.0、20.0 μg/kg時(shí),各真菌毒素對(duì)應(yīng)的T線顯色值明顯比陰性對(duì)照顯色值淺,表明應(yīng)用軟件分析檢測(cè)線灰度值的變化,可以獲得更低的檢測(cè)限。

圖3 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 應(yīng)用多重膠體金試紙條檢測(cè)玉米樣品中5種真菌毒素

對(duì)11個(gè)玉米樣品用多重膠體金試紙條方法進(jìn)行檢測(cè),用手機(jī)記錄檢測(cè)結(jié)果,并進(jìn)行肉眼觀察判定,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 多重膠體金試紙條檢測(cè)實(shí)際玉米樣品中的5種真菌毒素

由檢測(cè)結(jié)果可知,部分樣品中DON和ZEN濃度超過(guò)消線值,表明實(shí)際樣品中這2種毒素存在高濃度的污染;同時(shí),用Image J軟件提取天然污染玉米樣品的灰度值,結(jié)合玉米基質(zhì)多毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,可以得出污染玉米樣品中真菌毒素的濃度值。分析實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,1號(hào)玉米樣品中,DON、ZEN的灰度值為0,肉眼可觀察到檢測(cè)線消失,因此可以判定DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于200 μg/kg。同理,樣品3、4、5、6中DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于400μg/kg,ZEN質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于200 μg/kg。樣品2中AFB1的灰度值192.61,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,AFB1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為100 μg/kg。樣品7中DON和ZEN的灰度值分別為72.95和156.78,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線知,DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為95 μg/kg。樣品8中DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為70 μg/kg,樣品9中,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為160 μg/kg,樣品10中,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為120 μg/kg,樣品11中,DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg。11個(gè)樣品中,除樣品2以外,其他樣品中的ZEN和DON含量較高。樣品2雖受到ZEN和DON毒素的污染較小,但AFB1毒素污染的程度較重,不適合用于直接消費(fèi)或作為食品原料使用。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了適用于玉米樣品中多種真菌毒素同時(shí)提取的樣品提取溶劑并進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),建立5種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用優(yōu)化后的最佳提取溶劑對(duì)11個(gè)玉米實(shí)際樣品進(jìn)行前處理,結(jié)合膠體金試紙條對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)樣品中存在不同程度的AFB1、DON和ZEN污染。本研究所研制的多重膠體金試紙條能用于玉米的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),并結(jié)合Image J軟件能夠進(jìn)行定量分析。