繆福俊, 單春蘭, 耿樹香, 寧德魯, 郭剛軍

(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院1,昆明 650201)

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院2,貴陽 550025)

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所3,景洪 666100)

腸道是機(jī)體營養(yǎng)消化與吸收的最大場所,炎癥性腸病已成為全球性疾病,與腸道黏膜免疫、氧化應(yīng)激、炎性因子等變化密切相關(guān)[1-3]。Toll樣受體(TLRs)是腸上皮細(xì)胞、免疫系統(tǒng)和微生物之間的媒介,可通過調(diào)節(jié)黏膜免疫、炎癥、穩(wěn)態(tài)、腸道菌群等方面參與炎癥性腸病的發(fā)生[4,5]。脂多糖(LPS)是誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)的經(jīng)典藥物,也是Toll樣受體4(TLR4)重要配體之一[6,7]。LPS/TLR4信號通路是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要炎癥通路之一,其中TLR4/細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路已成為研究許多抗炎藥物,包括天然化合物的經(jīng)典信號通路和藥理靶點[8,9]。

近年來,食用富含油酸的油茶、油橄欖等油脂對腸道產(chǎn)生的多種藥理功效不斷被研究報道,不僅可以改善腸道的營養(yǎng)狀況,還可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)腸道黏膜屏障及直接抗炎作用來改善腸道病理[10,11]。此外,棕櫚油酸被證明是一種具有抗炎、預(yù)防動脈粥樣硬化、改善代謝綜合征、改善胰島素敏感性等多種生物功能活性的脂因子,它是一種Omega-7脂肪酸,來源常見于深海魚類或海藻中[12,13]。澳洲堅果油是一個很好的油酸和棕櫚油酸來源。

澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)是山龍眼科澳洲堅果屬植物,為世界著名堅果。澳洲堅果是我國重要的木本油料之一,種植面積已躍居世界第一位,主要種植區(qū)域為云南、廣西、廣東、貴州等省份[14,15]。澳洲堅果具有極高的經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值,其果仁營養(yǎng)豐富,含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%～90%油脂[16]。澳洲堅果油由飽和脂肪酸(硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸等)和不飽和脂肪酸(油酸、棕櫚油酸、亞油酸等)組成,以油酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%～65%)和棕櫚油酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%～20%)為主。此外,澳洲堅果油(MO)中還含有多種藥理活性成分,如α-生育酚、β-谷甾醇、多酚類物質(zhì)、角鯊烯等[17-19]。

因此,澳洲堅果油是研究機(jī)體腸道益生功能的極好來源。然而,澳洲堅果油對炎癥性腸病是否具有改善作用尚不清楚。探究澳洲堅果油對小鼠腸道損傷的改善作用及其機(jī)理,可為機(jī)體腸道健康和疾病的預(yù)防治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

澳洲堅果仁;24只昆明種雄性小鼠平均體質(zhì)量為(22±2)g,許可證號SCXK(滇)K2015-0002;普通維持飼料[許可證號SCXK(京)2018-06073];T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA試劑盒,Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄、SYBR Green試劑盒, TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒。

6YY-280全自動液壓榨油機(jī),BECKMAN Allegra 64R超速冷凍離心機(jī),BIOTEK ELx800TM酶標(biāo)儀,LEICA RM2135石蠟切片機(jī),OLYMPUS BX43F正置顯微鏡,BIO-RAD CFX96Touch熒光定量PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 澳洲堅果油脂肪酸組成

澳洲堅果仁在云南省木本油料工程研究中心經(jīng)液壓榨油機(jī)壓榨獲得,其脂肪酸組成信息為:棕櫚油酸(C16∶1)質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.75%、棕櫚酸C16∶0質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.17%,油酸(C18∶1)質(zhì)量分?jǐn)?shù)62.66%,硬脂酸(C18∶0)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.33%,亞油酸(C18∶2)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.47%[17]。

1.2.2 動物分組與給藥

小鼠飼養(yǎng)條件[SYXK(滇)K2018-0008]:12 h日光燈明暗交替循環(huán),自由進(jìn)食和飲水,溫度為(25±2) ℃,濕度為(40±5)%。將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組:對照組(CON)、澳洲堅果油組(MO)、LPS模型組(LPS)和LPS+MO組,每組6只。MO組和LPS+MO組連續(xù)灌胃澳洲堅果油[2.5 mL/(kg·d)]2周,灌胃后常規(guī)飼養(yǎng),動物自由食水。第15天,LPS組和LPS+MO組通過腹腔注射LPS(5 mg/kg,溶于無菌生理鹽水)造成急性腸道損傷[7]。CON組和MO組腹腔注射無菌生理鹽水(10 μL/g)。注射6 h 后,脫臼處死并快速取出腸道組織。實驗動物倫理審批號EAE-GZU-2022-E021。

1.2.3 腸道組織病理的檢查

截取各處理組小鼠空腸組織(接近十二指腸端)1～2 cm于4%多聚甲醛固定48 h,經(jīng)酒精脫水和石蠟包埋后進(jìn)行切片(5 μm)。經(jīng)蘇木精-伊紅(H&E)染色,中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 腸道組織抗氧化指標(biāo)檢測

稱取各處理組小鼠空腸組織0.5 g,于玻璃勻漿管內(nèi),加入4.5 mL生理鹽水,研磨至組織勻漿化,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝勻漿。根據(jù)總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)說明書檢測腸道組織中的含量。

1.2.5 腸道組織TLR4和NF-κB mRNA相對表達(dá)檢測

根據(jù)TLR4和NF-κB基因設(shè)計引物(北京擎科生物公司合成),引物序列見表1所示。根據(jù)RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對各處理組空腸組織進(jìn)行RNA提取和cDNA轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組空腸組織中TLR4和NF-κB mRNA相對表達(dá)量。選用β-actin基因作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系:引物各1 μL、SYBR Mix 10 μL、cDNA模版2 μL、ddH2O 6 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,(95 ℃變性5 s、Tm退火20 s、72延伸30 s,35×循環(huán))。

表1 目的基因的引物設(shè)計

1.2.6 腸道組織NF-κB蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組化(IHC)方法檢測各處理組小鼠空腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平。對空腸組織進(jìn)行石蠟包埋和切片。采用二甲苯溶液進(jìn)行脫蠟、乙醇復(fù)水、檸檬酸抗原液修復(fù)、過氧化氫酶孵育,加入NF-κB抗體(1∶400),37 ℃孵育1 h。加入50 μL DAB試劑顯色3～5 min。蘇木素復(fù)染10 min后,進(jìn)行梯度乙醇脫水,二甲苯透明。采用中性樹膠封片,于光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.7 腸道組織TNF-α和IL-6含量檢測

分別稱取各處理組小鼠空腸組織1.0 g,采用生理鹽水制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿。按照ELISA檢測試劑盒操作步驟分別進(jìn)行腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量檢測。依次加入100 μL TNF-α或IL-6抗體(37 ℃,60 min),再加入100 μL HRP工作液(37 ℃,30 min),最后加入90 μL顯色劑(37 ℃,15 min),在450 nm處測OD值。

1.2.8 統(tǒng)計與分析

采用SPSS 23.0軟件和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖。多組間分析采用Duncan法進(jìn)行比較檢驗,用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅果油對腸道病理的影響

腹腔注射LPS可短時間內(nèi)引起小鼠小腸急性損傷:腸絨毛破裂、上皮脫落、水腫、炎性細(xì)胞浸潤等[7]。首先,對各處理組小鼠空腸組織進(jìn)行H&E染色,觀察病理變化情況(圖1)。CON組和MO組小鼠腸道無組織學(xué)病變,絨毛結(jié)構(gòu)完整。LPS組小鼠腸道絨毛斷裂,上皮細(xì)胞脫落,固有層炎性細(xì)胞浸潤。LPS+MO組小鼠腸道損傷較輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,腸絨毛恢復(fù)。表明澳洲堅果油能改善LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道病理變化。

圖1 小鼠空腸組織病理結(jié)構(gòu)(H&E染色,400×)

2.2 澳洲堅果油對腸道氧化水平的影響

當(dāng)LPS進(jìn)入腸道后,會引起氧化應(yīng)激,降低腸道的抗氧化能力[20]。生物機(jī)體中評價抗氧化能力時,T-AOC、SOD和GSH-Px、MDA等是評價機(jī)體抗氧化水平的主要檢測指標(biāo)。由圖2可見,與CON組相比,MO組空腸組織T-AOC、SOD和GSH-Px水平顯著增高(P<0.05或P<0.01),MDA含量顯著降低(P<0.05);LPS組空腸組織T-AOC、SOD和GSH-Px水平極顯著下降(P<0.01),而MDA含量極顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+MO組T-AOC、SOD和GSH-Px的水平極顯著上升(P<0.01),而MDA含量極顯著降低(P<0.01)。表明澳洲堅果油具有顯著抗氧化作用,并且能提高LPS誘導(dǎo)炎癥空腸的抗氧化能力。郭剛軍等[17]研究表明澳洲堅果油對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除能力,具有一定的清除2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基的能力與還原力。廣泛的證據(jù)表明澳洲堅果油中的微量活性成分(多酚類物質(zhì)、β-谷甾醇、角鯊烯等)具有抗炎和抗氧化作用[21,22]。

2.3 澳洲堅果油對腸道TLR4和NF-κB m RNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

TLR4/NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的腸道損傷模型中起關(guān)鍵調(diào)控作用,當(dāng)TLR4和LPS結(jié)合后,活化NF-κB炎性通路,誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)及分泌,進(jìn)而加劇炎癥的病理癥狀[18]。采用qRT-PCR檢測了各處理組小鼠空腸組織中TLR4和NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖3所示。與CON組相比,MO組TLR4和NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異(P>0.05)。LPS處理后能極顯著上調(diào)TLR4和NF-κB m RNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+MO組空腸組織中TLR4和NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(P<0.01)。澳洲堅果油可以抑制LPS誘導(dǎo)的空腸組織TLR4/NF-κB通路活化,可能與富含的油酸和棕櫚油酸相關(guān)。趙曉等[11]研究表明富含高油酸的橄欖油可通過抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道TLR4通路相關(guān)因子表達(dá),減少促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)釋放。Souza等[23]研究表明棕櫚油酸可通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、IL-6和環(huán)氧合酶(COX-2)基因的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。Tsai等[24]研究表明棕櫚油酸可通過抑制TLR4信號通路改善LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),棕櫚油酸對改善炎癥的機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

圖3 小鼠空腸組織中TLR4(a)和NF-κB(b)mRNA相對表達(dá)水平

2.4 澳洲堅果油對腸道NF-κB蛋白表達(dá)的影響

進(jìn)一步采用免疫組化方法驗證了小鼠空腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平,結(jié)果如圖4所示。MO組與CON組相比,無顯著差異(P>0.05)。與Con組相比,LPS組NF-κB蛋白水平極顯著增高(P<0.01)。與LPS相比,LPS+MO組NF-κB蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01)。提示澳洲堅果油可以抑制LPS誘導(dǎo)的空腸組織中NF-κB蛋白的表達(dá)。

圖4 小鼠空腸組織中NF-κB免疫組化(a, 400×)和蛋白表達(dá)(b)

2.5 澳洲堅果油對腸道炎性因子表達(dá)水平的影響

TNF-α和IL-6作為TLR4/NF-κB通路中最初產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子,也是該信號通路中主要檢測兩個炎癥因子,在機(jī)體中會降低腸道黏膜的屏障功能,加劇腸道炎癥反應(yīng)[25]。采用ELISA檢測了各處理組小鼠腸道組織中促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平,結(jié)果如圖5所示。與CON組相比,MO組中IL-6含量顯著下調(diào)(P<0.05),TNF-α無顯著差異(P>0.05)。與Con組相比,LPS組TNF-α和IL-6含量極顯著升高(P<0.01)。與LPS相比,LPS+MO組TNF-α和IL-6含量極顯著下降(P<0.01)。表明澳洲堅果油可以降低腸道炎性因子水平。

圖5 小鼠空腸組織中TNF-α(a)和IL-6(b)表達(dá)水平

3 結(jié)論

以LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道急性損傷為模型,探討了澳洲堅果油是否通過TLR4/NF-κB通路改善腸道損傷病理。澳洲堅果油可以通過提高抗氧化酶活性和抑制TLR4/NF-κB通路中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平減輕LPS誘導(dǎo)的急性腸道損傷。澳洲堅果油在腸道抗炎方面具有積極作用,可能與其富含的油酸和棕櫚油酸密切相關(guān)。然而,具體的抗炎機(jī)制需要進(jìn)一步研究加以證實。