黨佳敏, 杜雙奎,2, 王麗英,2

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1,楊凌 712100)

(糧油功能化加工陜西省高校工程研究中心2,楊凌 712100)

玉米肽是以玉米蛋白粉作為原料,通過酶解或微生物發(fā)酵獲得的小分子肽,一般由2～20個(gè)氨基酸構(gòu)成,分子質(zhì)量通常為300～3 000 u。與蛋白質(zhì)和游離氨基酸相比,肽類具有營養(yǎng)價(jià)值高、生物活性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[1]。研究發(fā)現(xiàn),玉米肽具有多種生物活性,如抗氧化活性、抗癌活性、改善糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防酒精性肝損傷等[2-4],在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。目前,玉米肽已被國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為首批納入食品資源名錄的肽類產(chǎn)品之一[5]。因此,研究開發(fā)玉米源活性肽不僅能夠有效提升玉米加工副產(chǎn)品玉米蛋白粉的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)具有作為功能因子應(yīng)用于健康食品和功能食品的潛力。

酶解食源性蛋白是制備活性肽的主要方法。許多食源性蛋白例如魚、牛奶、雞蛋、大豆、小麥和玉米等都被開發(fā)利用來制備具有抗氧化活性的酶解物或肽。由于酶解是不完全水解,水解產(chǎn)物為多肽而蛋白質(zhì)中原有的氨基酸不發(fā)生任何變化,所以保留了氨基酸本身的生物活性,且反應(yīng)溫和、高效、安全性好[6]。

玉米肽的抗氧化活性是玉米肽研究的熱點(diǎn)。在前期研究中,利用堿性蛋白酶制備玉米肽,發(fā)現(xiàn)其具有良好的體外自由基和細(xì)胞內(nèi)活性氧清除活性,并且玉米肽還能夠升高過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶以及谷胱甘肽還原酶的活性[7]。脂質(zhì)過氧化是指多不飽和脂肪酸中發(fā)生的一種自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),可引起機(jī)體細(xì)胞膜流動(dòng)性及通透性發(fā)生改變、造成DNA及蛋白質(zhì)損傷[8,9],進(jìn)而影響細(xì)胞功能,導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、腫瘤、衰老、神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病的產(chǎn)生[10]。目前,對(duì)玉米肽抗氧化活性的研究主要集中于自由基或活性氧清除活性方面[11-15],而對(duì)其脂質(zhì)過氧化抑制活性的研究報(bào)道較少,限制了玉米源抗氧化肽在含脂質(zhì)食品中的應(yīng)用。

研究以玉米蛋白粉為原料,通過多種蛋白酶水解制備玉米肽,利用亞油酸過氧化、卵黃脂質(zhì)過氧化及小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化模型,系統(tǒng)評(píng)價(jià)玉米肽對(duì)不同來源脂質(zhì)過氧化的抑制作用,為玉米肽在預(yù)防或抑制含脂質(zhì)食品中脂質(zhì)過氧化中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62%),堿性蛋白酶(酶活力1 000 U/mg),風(fēng)味蛋白酶(酶活力1 000 U/mg),中性蛋白酶(酶活力1 000 U/mg),胃蛋白酶(酶活力 3 200 U/mg),胰液酶(酶活力3×USP specifications),L-亮氨酸,2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS),2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH),6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox),SPF級(jí)2月齡C57BL/6J小鼠(合格證書編號(hào):20220526Abzz0600000940),所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速粉碎機(jī),HC-3013R高速冷凍離心機(jī),FA200C電子天平,LNG-HFM-101膜分離裝置,Xiande-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,LGJ-10C真空冷凍干燥裝置,SparkTM多功能酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米肽制備

玉米蛋白水解制備玉米肽參考You等[16]的方法并做適當(dāng)修改。取玉米蛋白粉溶于去離子水,配置一定濃度的玉米蛋白溶液,在溫度為90 ℃條件下加熱10 min使蛋白變性,冷卻后用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH。分別添加一定量的堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶于冷卻后的玉米蛋白溶液中,持續(xù)水解180 min,具體水解條件如表1所示。將反應(yīng)體系再次加熱至90 ℃并保持10 min使蛋白酶失活。

表1 不同蛋白酶酶解條件及水解度

另外配置2 g/100 mL玉米蛋白溶液,參考Ding等[17]的方法,對(duì)玉米蛋白進(jìn)行體外模擬胃腸道消化,即90 ℃條件下加熱10 min使蛋白質(zhì)變性,冷卻至37 ℃,先使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,加入胃蛋白酶,在pH=2.0、37 ℃的條件下水解90 min,然后使用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入2 mg/100 mg胰液酶,在pH=7.0、37 ℃的條件下水解240 min,加熱至90 ℃保持10 min,使蛋白酶失活。

前述酶解液一部分直接收集后冷凍干燥,用于水解度及玉米肽總得率測(cè)定,另一部分通過4 000 r/min離心10 min,收集上清液,利用截留分子質(zhì)量為1 000 u和3 000 u的超濾膜進(jìn)行超濾分離,收集分子質(zhì)量<1 000 u的玉米肽組分1(CPF1)和分子質(zhì)量1 000～3 000 u的玉米肽組分2(CPF2),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空冷凍干燥,稱重CPF1和CPF2組分計(jì)算得率,于-20 ℃保存。

1.3.2 玉米蛋白水解度的測(cè)定

參考周慧江等[18]的方法并稍作改進(jìn)。向96孔板中加入5 μL 0.5 mg/mL的玉米蛋白水解液,再加入40 μL 0.212 5 mg/mL pH為8.2的磷酸鹽緩沖液和40 μL 0.1 g/100 mL的TNBS水溶液,在避光條件下,50 ℃恒溫振蕩60 min,取出后,再加入80 μL 0.1 mol/L的HCl終止反應(yīng),震蕩混勻后,室溫冷卻30 min,在340 nm下測(cè)定吸光值。以未經(jīng)酶解的玉米蛋白溶液為空白對(duì)照組,以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白水解度(DH)計(jì)算公式見式(1)和式(2)。

(1)

(2)

式中:cs為樣品組對(duì)應(yīng)的L-亮氨酸濃度/mmol/L;c0為空白對(duì)照組對(duì)應(yīng)的L-亮氨酸濃度/mmol/L;hs為樣品組肽鍵數(shù)/mmol/g;h0為空白對(duì)照組肽鍵數(shù)/mmol/g;ht為玉米蛋白肽鍵總數(shù)/7.8 mmol/g;V為樣品體積/L;m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 ABTS自由基清除活性測(cè)定

參考王晨陽等[19]的方法并稍作改進(jìn)。ABTS工作液的配制:將14 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,放置在暗處反應(yīng)12～16 h。使用前,用PBS緩沖液(75 mmol/L,pH 7.4)進(jìn)行稀釋,直至在734 nm下的吸光值為0.70±0.02。取96孔板,每孔加入150 μL稀釋后的ABTS工作液,實(shí)驗(yàn)分為樣品組和對(duì)照組,樣品組中每孔加入50 μL玉米肽溶液(終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.50、25.00、62.50、125.00 μg/mL),空白對(duì)照組每孔加入50 μL蒸餾水,陽性對(duì)照組每孔加入50 μL終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.50、25.00、62.50、125.00 μg/mL的Trolox溶液。室溫反應(yīng)10 min后,測(cè)定其在734 nm下的吸光值,ABTS自由基清除率計(jì)算公式見式(3)。

(3)

根據(jù)Trolox的濃度與ABTS自由基清除率回歸方程,計(jì)算玉米肽樣品的Trolox當(dāng)量(Trolox equivalent, TE),即mmol TE/g肽。

1.3.4 硫氰酸鐵(FTC)法測(cè)定玉米肽對(duì)亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制作用

參考Bakir等[20]的方法測(cè)定,測(cè)定方法如下:取亞油酸13 μL與99.5%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液1 mL配制成亞油酸-乙醇溶液。取離心管分別加入0.5 mL 0.2 mg/mL的玉米肽溶液、0.5 mL 5 mmol/L PBS緩沖液、1.013 5 mL亞油酸-乙醇溶液,放入40 ℃烘箱進(jìn)行孵育,每隔24 h取出,取30 μL反應(yīng)液體,加入1.41 mL 75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇、30 μL 30 g/100 mL的硫氰酸銨、30 μL 20 mmol/L氯化亞鐵(用3.5%體積分?jǐn)?shù)的鹽酸配制),反應(yīng)3 min,在500 nm下測(cè)量吸光度值,連續(xù)測(cè)量7 d,以維生素C作為陽性對(duì)照。玉米肽對(duì)亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制率計(jì)算公式見式(4)。

(4)

1.3.5 硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定玉米肽對(duì)卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用

卵黃脂質(zhì)過氧化測(cè)定參照韓婭婷等[21]的方法并作修改,具體操作如下:雞蛋去卵清,取卵黃用等體積0.1 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液配置成1∶1的懸液,室溫下均質(zhì)30 s,再次使用PBS緩沖液稀釋成1∶25的卵黃懸液,均質(zhì)30 s。取離心管分別加入60 μL 1∶25卵黃懸液、60 μL 25 mmol/L FeSO4溶液和180 μL PBS緩沖液,樣品組加入300 μL玉米肽溶液(終質(zhì)量濃度分別為5.71、11.43、17.14、22.86、28.57 mg/mL),空白對(duì)照組加入300 μL PBS緩沖液,混合均勻,37 ℃水浴下反應(yīng)4 h,依次加入150 μL 50 g/100 mL的TCA,300 μL 0.8 g/100 mL的TBA,沸水浴20 min,冷卻后3 500 r/min 離心15 min,測(cè)量532 nm下吸光度值。玉米肽對(duì)卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制率計(jì)算公式見式(5)。

(5)

1.3.6 玉米肽對(duì)動(dòng)物肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制作用

小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化測(cè)定參考郭紅英等[22]的方法并稍作改進(jìn)。小鼠禁食12 h后,利用頸椎脫臼法處死,迅速取出其肝臟組織,置于冷生理鹽水漂洗干凈,以生理鹽水為勻漿介質(zhì),制成10 g/100 mL組織勻漿,3 500 r/min離心10 min,取上清液,4 ℃冷藏備用。

取200 μL 10 g/100 mL小鼠肝臟勻漿于各試管,實(shí)驗(yàn)組加入100 μL玉米肽溶液(終質(zhì)量濃度分別為0.11、1.11、2.22、5.55、8.89、11.11 mg/mL),空白對(duì)照組加入100 μL蒸餾水,37 ℃水浴振蕩反應(yīng)30 min。加入200 μL 200 mmol/L的AAPH溶液,37 ℃水浴振蕩,反應(yīng)120 min,冷卻至室溫后,加入200 μL 20 g/100 mL的TCA終止反應(yīng)。加入200 μL 0.67 g/100 mL的TBA,混合均勻,沸水浴15 min,冷卻至室溫后,3 500 r/min離心10 min,測(cè)定其在532 nm處的吸光值。玉米肽對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制率計(jì)算公式見式(6)。

(6)

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,利用單因素方差分析(ANOVA)以及Duncan 多重比較來確定數(shù)據(jù)間的顯著性,差異顯著水平為P<0.05。采用Origin 2021軟件進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米肽的ABTS自由基清除活性

如表1所示,中性蛋白酶對(duì)玉米蛋白的水解度最高,為(33.43±6.89)%;堿性蛋白酶次之,為(26.74±3.45)%;模擬胃腸道消化(胃蛋白酶+胰液酶)和風(fēng)味蛋白酶水解得到的玉米肽水解度最低,為(22.89±3.25)%和(18.21±3.84)%(P<0.05)。

玉米肽總肽及CPF1、CPF2組分的得率如表2所示?？傠牡寐手心M胃腸道消化制備的玉米肽得率最高,為(90.42±8.81)%;在CPF1組分得率中,堿性蛋白酶制備的CPF1得率最高,為(10.37±0.51)%;在CPF2組分得率中,中性蛋白酶制備的CPF2得率最高,為(18.83±0.28)%。

表2 玉米肽得率/%

ABTS自由基清除活性評(píng)價(jià)體系同時(shí)適用于脂溶性和水溶性兩類化合物,尤其適用于蛋白水解物等肽類物質(zhì)的自由基清除活性評(píng)價(jià),在ABTS體系中,抗氧化肽可以作為供電子體或供質(zhì)子體與自由基發(fā)生反應(yīng)[23]。因此,本研究測(cè)定了玉米肽的ABTS自由基清除活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同蛋白酶水解得到的玉米肽均具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除活性,且呈劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為125.00 μg/mL時(shí),不同蛋白酶水解得到玉米肽的ABTS自由基清除活性為53.43%～78.61%,如圖1所示。對(duì)于CPF1(圖1a),當(dāng)玉米肽的質(zhì)量濃度達(dá)到125.00 μg/mL時(shí),模擬胃腸道消化所制備的玉米肽ABTS自由基清除活性最高,為(78.61±0.56)%,中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽ABTS自由基清除活性次之,分別為(66.18±1.62)%和(65.93±1.56)%,而堿性蛋白酶制備的玉米肽ABTS自由基清除活性相對(duì)較弱,為(55.32±0.69)%(P<0.05)。對(duì)于CPF2(圖1b),當(dāng)玉米肽的質(zhì)量濃度達(dá)到125.00 μg/mL時(shí),中性蛋白酶制備的玉米肽ABTS自由基清除率最高,為(74.09±0.44)%,堿性蛋白酶和模擬胃腸道消化制備的玉米肽ABTS自由基清除活性次之,分別為(71.70±0.37)%和(68.21±0.32)%,而風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽ABTS自由基清除活性相對(duì)較弱,為(53.43±0.76)%(P<0.05)。使用不同的蛋白酶水解玉米蛋白時(shí)由于其酶切位點(diǎn)不同,所保留特定氨基酸的殘基種類、位置不同,造成了玉米肽清除ABTS自由基活性的差異性。例如,堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要為疏水性或芳香族氨基酸的肽鍵;中性蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要是疏水性氨基酸;風(fēng)味蛋白酶具有外切酶和內(nèi)切酶的效果,酶解得到寡肽的可能性很高;胰蛋白酶主要作用于堿性氨基酸,僅將蛋白水解成大片段的多肽;而胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶,其作用位點(diǎn)通常為Phe、Trp、Tyr等疏水性氨基酸,具有廣泛的特異性[24]。研究發(fā)現(xiàn),一些特殊的氨基酸如His、Tyr、Met、Leu、Trp、Lys和Cys等均具有較強(qiáng)的抗氧化活性,另外疏水性氨基酸Ala、Met、Ile、Leu、Phe、Pro和Trp也可能與肽的抗氧化活性相關(guān)[25,26]。

注:不同字母表示相同玉米肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下,利用不同蛋白酶水解所得玉米肽的ABTS自由基清除率之間差異顯著(P<0.05)。圖1 玉米肽ABTS自由基清除活性

玉米肽ABTS自由基清除活性的IC50及Trolox當(dāng)量如表3所示。其中,模擬胃腸道消化制備的玉米肽CPF1組分的ABTS自由基清除活性IC50最低,為(32.65±0.95)μg/mL,其Trolox當(dāng)量為(3.65±0.11)mmol TE/g肽,堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF2組分次之,其IC50和Trolox當(dāng)量分別為(49.19±1.89) μg/mL和(2.42±0.09)mmol TE/g肽。風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽CPF1、中性蛋白酶和模擬胃腸道消化制備的玉米肽CPF2也具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除活性,IC50分別為(56.81±2.37)、(58.70±1.54)、(63.61±1.39)μg/mL,其Trolox當(dāng)量分別為(2.10±0.09)、(2.03±0.05)、(1.87±0.04)mmol/L TE/g肽。

表3 玉米肽ABTS自由基清除活性IC50及Trolox當(dāng)量

2.2 玉米肽的亞油酸過氧化抑制作用

亞油酸是人體所必需的重要不飽和脂肪酸,對(duì)降低血脂、軟化血管、降低血壓等有促進(jìn)作用。由于亞油酸雙鍵電子云密度大,化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定,容易受到過氧化作用損傷,產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化物[27]。中間產(chǎn)物自由基導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的聚合,亞油酸脂質(zhì)過氧化能夠破壞人體細(xì)胞正常生理功能,促使人體衰老以及誘發(fā)癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化[28]。

本研究以硫氰酸鐵法測(cè)定玉米肽的亞油酸脂質(zhì)過氧化抑制作用,亞油酸氧化產(chǎn)物丙二醛的生成量以反應(yīng)液的吸光度值表示,吸光度值越小,丙二醛生成量越少,即玉米肽的亞油酸過氧化脂質(zhì)抑制能力越強(qiáng)。由圖2可知,所有蛋白酶所制備出的玉米肽組分CPF1和CPF2的吸光度值均低于空白對(duì)照組,即均表現(xiàn)出一定的亞油酸過氧化抑制能力,且抑制能力隨作用時(shí)間的延長而上升。第7天時(shí),玉米肽在終質(zhì)量濃度為28 μg/mL時(shí)的亞油酸過氧化抑制率如圖3所示。分析發(fā)現(xiàn),風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽CPF1組分的亞油酸過氧化抑制活性最高,為(72.54±1.15)%,風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽CPF2組分次之,為(62.04±3.27)%。模擬胃腸道消化和中性蛋白酶制備的玉米肽CPF2組分也具有較高的亞油酸過氧化抑制活性,為(45.02±0.94)%和(54.82±17.35)%;而其CPF1組分的亞油酸過氧化抑制活性相對(duì)CPF2較低,為(40.89±12.48)%和(31.88±13.08)%。堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF1和CPF2的亞油酸過氧化抑制活性均低于10%。當(dāng)多肽的N-端為疏水性氨基酸時(shí),可以與脂肪酸相互反應(yīng),從而使得多肽具有捕捉脂質(zhì)自由基的能力[29]。風(fēng)味蛋白酶是一種混合型蛋白酶,含有內(nèi)切酶和外切酶,在酶解初期內(nèi)切酶將蛋白水解成多肽,內(nèi)切酶切位點(diǎn)多位于疏水性氨基酸殘基,之后在外切酶作用下從肽鏈末端釋放氨基酸,繼而形成更多氨基酸和短肽,具有較高的酶解效率和特異性[30]。類似研究結(jié)果也有文獻(xiàn)報(bào)道,如任瑋等[31]測(cè)定了工業(yè)化生產(chǎn)的食源性低聚肽在亞油酸自氧化體系中的抗氧化活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)終質(zhì)量濃度為27.00 μg/mL時(shí),2 h內(nèi)大豆肽和海洋膠原肽對(duì)于亞油酸自氧化的抑制率分別達(dá)到75.16%和58.69%,玉米肽抑制率約為33.00%,海洋骨原肽的抑制率為45.66%。值得注意的是,在本研究中,利用風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽CPF1和CPF2組分以及利用中性蛋白酶和模擬胃腸道消化制備的玉米肽CPF2組分的亞油酸過氧化抑制活性均大于陽性對(duì)照維生素C(42.56±1.35)%,顯示出其作為亞油酸過氧化抑制劑應(yīng)用于含脂質(zhì)食品的良好潛力。

注:不同字母表示相同玉米肽濃度下不同蛋白酶制備玉米肽的亞油酸過氧化抑制作用數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。圖2 玉米肽的亞油酸過氧化抑制作用

注:不同字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。圖3 第7天時(shí)玉米肽的亞油酸過氧化抑制作用

2.3 玉米肽的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用

卵黃脂蛋白溶液富含多不飽和脂肪酸,在Fe2+催化下易發(fā)生脂質(zhì)過氧化,生成丙二醛(MDA),MDA在酸性條件下可與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生粉紅色反應(yīng)物,在532 nm處有特征吸收[32]。研究利用FeSO4誘導(dǎo)卵黃脂質(zhì)過氧化體系,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定玉米肽的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用。如圖4所示,不同蛋白酶水解得到的玉米肽CPF1和CPF2組分均具有一定的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用且其抑制作用與濃度呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。

注:不同字母表示相同玉米肽濃度下不同蛋白酶水解所得玉米肽的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制活性數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。圖4 玉米肽的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用

堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF1組分的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用最強(qiáng),在質(zhì)量濃度為17.14 mg/mL時(shí),其卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用為(84.75±0.48)%;堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF2組分和模擬胃腸道消化制備的玉米肽CPF1組分次之,在質(zhì)量濃度為17.14 mg/mL時(shí),其卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用分別為(69.20±2.02)%和(68.42±0.56)%。其他蛋白酶制備的玉米肽CPF1和CPF2組分在質(zhì)量濃度為28.57 mg/mL時(shí),其卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用處于(48.24±2.37)%～(61.35±0.10)%。研究顯示,活性肽的卵黃脂質(zhì)抗氧化活性與其分子組成、結(jié)構(gòu)、疏水性和氨基酸的殘基位點(diǎn)有關(guān)[33],但具體的抗氧化機(jī)制還不清楚。對(duì)于玉米肽的亞油酸脂質(zhì)過氧化相關(guān)內(nèi)容報(bào)道較少,劉小芳等[34]利用堿性蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白,發(fā)現(xiàn)當(dāng)南極磷蝦蛋白肽質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),對(duì)Fe2+誘導(dǎo)的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制率為(67.56±1.36)%。

不同蛋白酶制備的玉米肽的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用IC50如表4所示,堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF1和CPF2組分卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用的IC50最低,分別為(8.64±0.07)mg/mL和(14.02±0.23)mg/mL。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),玉米肽CPF1組分的卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用普遍強(qiáng)于CPF2組分(P<0.05),原因可能是分子質(zhì)量越小,其抗氧化基團(tuán)更容易暴露在分子外部,且小分子肽組分中含有更多末端氨基酸使其能與氧化基團(tuán)進(jìn)行吸附[35]。

表4 玉米肽卵黃脂質(zhì)過氧化抑制作用IC50

2.4 玉米肽的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的主要分解產(chǎn)物,其含量反映了組織脂質(zhì)過氧化程度,也間接反映了組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[36]。研究利用AAPH誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化體系,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定玉米肽的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用,如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同蛋白酶水解得到的玉米肽組分均具一定的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。

注:不同字母表示相同玉米肽濃度下不同蛋白酶水解所得玉米肽的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制活性數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。圖5 玉米肽的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用

在玉米肽質(zhì)量濃度為22.22 mg/mL時(shí)模擬胃腸道消化和堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF1組分其肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用最強(qiáng),分別為(61.96±0.34)%和(58.35±2.78)%;中性蛋白酶制備的玉米肽CPF1組分和風(fēng)味蛋白酶制備的玉米肽CPF1組分次之,分別為(57.30±0.61)%和(55.22±2.55)%,而玉米肽CPF2組分的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用相對(duì)于CPF1普遍較弱,低于55%。通過對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量的玉米肽組分其動(dòng)物肝臟脂肪過氧化能力強(qiáng)于高分子質(zhì)量的玉米肽組分。研究發(fā)現(xiàn),肽的分子質(zhì)量是影響其穿膜吸收的最重要的因素之一,分子質(zhì)量越大,越難以被完整吸收[37]。小分子質(zhì)量的肽容易被肝臟細(xì)胞吸收從而對(duì)脂質(zhì)過氧化起到更好的抑制作用。由此可見,蛋白酶解的特異性和酶解產(chǎn)物中肽段分子質(zhì)量的大小共同影響其脂質(zhì)過氧化活性的高低。類似研究結(jié)果也有文獻(xiàn)報(bào)道,陳紅漫等[38]利用堿性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白獲得了玉米肽組分,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量位于400～1 000 u的組分具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)氧化作用,在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)對(duì)小鼠肝組織體外脂質(zhì)過氧化抑制率達(dá)到30.65% 。

不同蛋白酶制備的玉米肽的肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用IC50如表5所示,中性蛋白酶制備的玉米肽CPF1抑制肝臟脂質(zhì)過氧化作用的IC50最低,為(9.79±0.76)mg/mL,模擬胃腸道消化水解和堿性蛋白酶制備的玉米肽CPF1次之,IC50分別為(10.68±1.33)、(10.99±1.07)mg/mL,模擬胃腸道消化制備的玉米肽CPF2的IC50較高,為(19.16±3.97)mg/mL。

表5 玉米肽肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用IC50

3 結(jié)論

研究利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及模擬胃腸道消化(胃蛋白酶+胰蛋白酶)制備玉米肽,在測(cè)定了玉米肽的ABTS自由基清除活性基礎(chǔ)上,重點(diǎn)從亞油酸、卵黃脂質(zhì)和動(dòng)物肝臟脂質(zhì)3個(gè)層次系統(tǒng)評(píng)價(jià)了玉米肽對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用。結(jié)果表明,玉米肽組分對(duì)亞油酸、卵黃脂質(zhì)及動(dòng)物肝臟脂質(zhì)的過氧化物均具有較好的抑制作用,而所使用的蛋白酶種類以及玉米肽組分的分子質(zhì)量皆會(huì)影響其ABTS自由基清除活性及脂質(zhì)過氧化抑制活性。本實(shí)驗(yàn)為玉米源活性肽的脂質(zhì)過氧化抑制作用提供了參考,玉米源活性肽可用作含脂質(zhì)食品的脂質(zhì)過氧化抗氧化劑,用來改善食品的品質(zhì)或延長保質(zhì)期,具有廣闊的應(yīng)用前景。