楊夢(mèng)君 魯進(jìn)韜 許原 陳曉 楊振德 熊運(yùn)凡 胡平

(廣西高校亞熱帶人工林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西大學(xué)),南寧,530004)

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)又稱松褐天牛,屬鞘翅目(Coleoptera)、天?？?Cerambycidae)、墨天牛屬(Monochamus)。松墨天牛是松樹重要的蛀干害蟲,同時(shí)也是全球毀滅性森林病害——松材線蟲病的主要傳播媒介,對(duì)我國馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarrière)、華山松(PinusarmandiiFranch.)、落葉松(LarixgmeliniiKuzen.)和雪松(CedrusdeodaraG. Don)等多種松樹造成嚴(yán)重危害,造成松林大面積死亡[1-2]。防止松材線蟲病蔓延的主要途徑之一是防控媒介昆蟲松墨天牛。常用的防控手段有及時(shí)清理枯死樹木、噴灑化學(xué)藥劑等,而在天牛的監(jiān)測(cè)上,植物源引誘劑扮演了重要角色。已有研究表明,添加了植物源揮發(fā)物的誘芯能顯著提升對(duì)天牛的誘捕效果[3]。因此,厘清松樹揮發(fā)物中的引誘活性物質(zhì)對(duì)松墨天牛的防控具有重要意義。

植物揮發(fā)物是指植物的地上部分散發(fā)產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs),主要為萜類、醇、醛、酯類化合物。大多數(shù)寄主植物受到害蟲的侵害時(shí),會(huì)改變揮發(fā)性組分的種類、比例、濃度,這些蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物(HIPVs)可影響昆蟲的行為,例如,棉花(Gossypiumspp.)被?；页嵋苟?SpodopteralittoralisBoisduval)取食后,誘導(dǎo)產(chǎn)生的4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯會(huì)抑制成蟲的交配和產(chǎn)卵行為[4];馬鈴薯甲蟲(LeptinotarsadecemlineataSay)的成蟲可被其幼蟲危害后的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)植株所吸引[5]。此外,蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物對(duì)于同寄主的不同植食性昆蟲也會(huì)產(chǎn)生一定的影響,有研究發(fā)現(xiàn),受到蚜蟲(MacrosiphumeuphorbiaeThomas)危害的番茄(SolanumlycopersicumL.)植株更能吸引甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHvbner)取食[6]。本課題組在對(duì)感染松材線蟲病初期和中期的馬尾松進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),在同時(shí)遭受松樹材小蠹(X.festivusEichhoff)危害的馬尾松嫩梢上極易發(fā)現(xiàn)被松墨天牛取食的痕跡。有試驗(yàn)證明,未交配的松墨天牛成蟲對(duì)于受害馬尾松揮發(fā)物呈負(fù)趨性[7],據(jù)此推測(cè),受小蠹蛀干危害的馬尾松枝揮發(fā)物能吸引松墨天牛成蟲前來取食,小蠹與松墨天牛存在協(xié)同危害的可能。本研究采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集受小蠹危害的馬尾松側(cè)枝與其生長(zhǎng)端上的1年生松嫩梢的揮發(fā)性組分,利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)和氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)(GC-EAD)初步鑒定其組分,并篩選出對(duì)松墨天牛有觸角電生理反應(yīng)的物質(zhì),為綜合防治松墨天牛提供參考。

1 材料與方法

供試植物：本試驗(yàn)在廣西南寧興寧區(qū)(地理中心坐標(biāo)為108°22′13.6″E,22°54′7.5″N),對(duì)3棵已經(jīng)感染松材線蟲病的馬尾松病株(圖1-A,B,C),采集受到松樹材小蠹危害的側(cè)枝,以及其生長(zhǎng)端的當(dāng)年生綠色嫩梢(圖1-D,E,F),側(cè)枝截面直徑約6 cm,長(zhǎng)度約30 cm,當(dāng)年生松梢長(zhǎng)度約40 cm。將采集后的植物材料裝入保鮮密封袋內(nèi)保濕,帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

A、B、C為馬尾松病株;D為被松墨天牛取食的嫩梢;E為被松樹材小蠹危害的側(cè)枝;F為1年生松嫩梢樣品。

供試蟲源：松墨天牛采自廣西南寧興寧區(qū),收集受害的馬尾松主干木段,帶回實(shí)驗(yàn)室隔離飼養(yǎng),待成蟲羽化后,裝入塑料杯內(nèi),用新鮮馬尾松枝條飼養(yǎng)。以未交配的雌蟲和雄蟲為供試蟲源。

植物揮發(fā)物的收集：采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集受害的馬尾松側(cè)枝和嫩梢的揮發(fā)物,將兩者分別放入聚對(duì)苯二甲酸乙二酯烘烤袋(江蘇申凱包裝高新技術(shù)股份有限公司,中國)內(nèi),利用QC-1S型大氣采樣儀(北京勞動(dòng)保護(hù)研究所)進(jìn)行抽提,進(jìn)氣口連接活性炭,出氣口連接填充了Porapark Q吸附劑(80/100目,Alltech,美國)的石英玻璃管,通過聚四氟乙烯軟管連接收集袋、活性炭、玻璃管、流量計(jì)(LZB-3WB)和大氣采樣儀,做好各部分連接的密封。先將袋內(nèi)空氣抽走,泵入活性炭過濾后的凈化空氣,氣體流量為400 mL/min,密封循環(huán)采氣6 h,采集均設(shè)3個(gè)重復(fù)。采集完成后,使用正己烷(色譜純)對(duì)玻璃管內(nèi)吸附的物質(zhì)進(jìn)行洗脫,隨后將洗脫液迅速放入冰箱-20 ℃保存。

揮發(fā)物組分測(cè)定：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS,7890B-7000D,安捷倫科技有限公司,美國)對(duì)受害后的馬尾松揮發(fā)物洗脫液進(jìn)行組分分析。氣相色譜配備HP-5毛細(xì)管柱,每次進(jìn)樣量為1 μL,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,不分流模式,檢測(cè)器溫度為300 ℃,載氣為He(1 mL/min)。升溫程序設(shè)置為先以10 ℃/min的速度升溫到80 ℃,再以3 ℃/min升溫到110 ℃,然后以5 ℃/min升溫到160 ℃,保持3 min,共運(yùn)行30 min。質(zhì)譜儀電離方式為電子電離(EI),能量為70 eV,離子源發(fā)生器溫度250 ℃,Scan掃描模式,質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)為30～350。

松墨天牛對(duì)揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)：氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD,7890B-IDAC4,安捷倫科技有限公司,美國;Styntech公司,德國)載氣為高純度N2(1 mL/min),分流比1∶1。其余條件設(shè)置同氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

使用手術(shù)刀將前期飼養(yǎng)的天牛雌、雄成蟲各一個(gè)觸角從基部切下,切除端節(jié)的少許末梢,用導(dǎo)電膠(spectra 360 Electrode,德國)將觸角兩端粘到金屬電極的兩極,最后將電極插入觸角電位儀探頭處,使用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀1.2.5軟件同時(shí)放大并記錄觸角電位(EAG)和氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)信號(hào)。試驗(yàn)雌雄成蟲各3頭,每個(gè)觸角測(cè)試重復(fù)3次。

數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis (B.07.00)軟件,根據(jù)各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖,連接由美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院建立的NIST 17標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫,進(jìn)行檢索分析各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù),選取質(zhì)譜匹配度高的化合物,定量分析采用峰面積百分比法確定各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過與氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀峰圖上的化合物峰形和保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比,鑒定出具有電生理反應(yīng)的物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 受害馬尾松側(cè)枝與嫩梢揮發(fā)物的成分與相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

對(duì)馬尾松揮發(fā)物采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析,其總離子流圖見圖2,具體的物質(zhì)見表1。從馬尾松側(cè)枝與嫩梢中檢測(cè)出的24種化合物以萜烯類居多,共21種,其中單萜化合物有9種,倍半萜化合物有12種,還有極微量酮類和酯類。側(cè)枝與嫩梢揮發(fā)物組分不同,嫩梢中含有20種,主要有α-蒎烯(57.93%)、左旋-β-蒎烯(15.26%)、假檸檬烯(13.15%)、莰烯(3.12%)、長(zhǎng)葉烯(2.09%)、萜品油烯(2.02%)等;側(cè)枝中含有16種,相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的為α-蒎烯(76.32%)、莰烯(5.03%)、右旋萜二烯(5.14%)、長(zhǎng)葉烯(4.47%)、左旋-β-蒎烯(3.61%)等。側(cè)枝和嫩梢中含有的相同組分為α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、別羅勒烯、(+)-α-長(zhǎng)葉蒎烯、(+)-環(huán)苜蓿烯、(+)-長(zhǎng)葉環(huán)烯、(+)-苜蓿烯、長(zhǎng)葉烯、β-石竹烯;不同的組分為右旋萜二烯、假檸檬烯、3-蒈烯、乙酸芳樟酯、3-乙基苯乙酮、左旋乙酸冰片酯、羅漢柏烯、(-)-α-可巴烯、β-波旁烯、β-欖香烯、β-可巴烯、大根香葉烯-D。兩個(gè)部位化合物組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也不同,差別較大的物質(zhì)有α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、假檸檬烯和長(zhǎng)葉烯;嫩梢中,左旋-β-蒎烯和假檸檬烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高;側(cè)枝中,α-蒎烯、右旋萜二烯和長(zhǎng)葉烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。本次嫩梢中檢測(cè)到的揮發(fā)性組分占到總離子流的98.01%,側(cè)枝為97.61%,剩余組分為少量雜質(zhì)和柱流失。

表1 受害馬尾松嫩梢與側(cè)枝的揮發(fā)物成分及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

續(xù)(表1)

圖2 馬尾松揮發(fā)物氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀總離子流圖

2.2 松墨天牛成蟲對(duì)受害馬尾松揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

由圖3可知,利用雌、雄成蟲觸角篩選得到的活性物質(zhì)是一致的。嫩梢中篩選出的有效物質(zhì)有7種,分別是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、假檸檬烯、萜品油烯、長(zhǎng)葉烯、β-石竹烯;馬尾松側(cè)枝中篩選出的有效物質(zhì)有5種,分別是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、長(zhǎng)葉烯。

A為對(duì)嫩梢的GC-EAD反應(yīng)。其中,1為α-蒎烯;2為莰烯;3為左旋-β-蒎烯;6為假檸檬烯;8為萜品油烯;21為長(zhǎng)葉烯;22為β-石竹烯;a為柱流失;♀為雌性成蟲;♂為雄性成蟲。B為對(duì)側(cè)枝的GC-EAD反應(yīng)。其中,1為α-蒎烯;2為莰烯;3為左旋-β-蒎烯;5為右旋萜二烯;21為長(zhǎng)葉烯;b為柱流失;♀為雌性成蟲;♂為雄性成蟲。

2.3 馬尾松健康與感病感蟲植株揮發(fā)物組分以及松墨天牛GC-EAD反應(yīng)的比較分析

通過對(duì)比一些健康馬尾松揮發(fā)物的相關(guān)研究結(jié)果[8-12],相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的化合物組分中,除了假檸檬烯與右旋萜二烯,其余組分種類基本一致。目前針對(duì)松墨天牛與寄主馬尾松之間的化學(xué)通訊已有很多研究結(jié)論,松墨天牛對(duì)健康馬尾松揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)試驗(yàn)篩選得到的物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、石竹烯、月桂烯、β-月桂烯、萜品油烯、長(zhǎng)葉烯、異己烯、雪松烯、乙酸龍腦酯等[13-14]。本次GC-EAD試驗(yàn)中初步篩選出的活性組分共有8種,除了右旋萜二烯,其余7種組分都存在于嫩梢的揮發(fā)物中,將篩選結(jié)果與前人研究進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),健康馬尾松與受害后馬尾松揮發(fā)物存在相同的組分,如α-蒎烯、萜品油烯、長(zhǎng)葉烯,同時(shí)也發(fā)現(xiàn),在健康馬尾松的揮發(fā)物組分中存在左旋-β-蒎烯,但相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,未能被篩選為活性物質(zhì),而在本試驗(yàn)中,受害后馬尾松左旋-β-蒎烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,故能被篩選出來。

3 結(jié)論與討論

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)受松樹材小蠹危害后的馬尾松側(cè)枝與嫩梢中的揮發(fā)物進(jìn)行檢測(cè),共鑒定得出24種化合物,其中87.5%為萜烯類。通過與健康松樹揮發(fā)物的對(duì)比發(fā)現(xiàn),相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的組分只有假檸檬烯與右旋萜二烯不同,推測(cè)這兩種物質(zhì)或與小蠹危害有關(guān)。松墨天牛的寄主包含多種松科樹種,例如云南松(PinusyunnanensisFranch.)、黑松(PinusthunbergiiParl.)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongholicaLitv.)以及紅松(PinuskoraiensisSiebold &Zucc.)等[15-18],單萜和倍半萜類化合物常存在于這類植物的揮發(fā)物中。如云南松松針的揮發(fā)物組分有α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯、β-欖香烯、石竹烯、α-石竹烯等[15],黑松松梢的揮發(fā)物組分有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯、α-萜品油烯、異長(zhǎng)葉烯等[18]。萜烯類化合物是植物揮發(fā)物中一類重要化合物,它使植物可與其周邊環(huán)境及生物保持互作關(guān)系,因此,松類植物揮發(fā)性的萜烯類物質(zhì)在與松墨天牛的化學(xué)通信中有重要作用。

有試驗(yàn)在對(duì)比了健康松梢揮發(fā)物與取食危害后揮發(fā)物的組分,以及使用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行觸角電位(EAG)測(cè)試后得出,α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和β-月桂烯為重要的活性物質(zhì)[19]。并且有研究證明,松墨天牛對(duì)寄主松樹揮發(fā)物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、月桂烯、檸檬烯、萜品油烯、β-石竹烯、β-水芹烯均可產(chǎn)生電生理活性[13,20-22],結(jié)合這些相關(guān)研究,本試驗(yàn)中,雌成蟲與雄成蟲氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)(GC-EAD)所篩選的活性物質(zhì)在影響天牛行為方面有不可忽視的作用。

松墨天牛對(duì)松樹揮發(fā)物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、右旋萜二烯、β-石竹烯等萜烯類物質(zhì)都具有顯著的趨向性[21,23]。其中,衰弱松樹揮發(fā)物中的(+)-α-蒎烯對(duì)松墨天牛有很好的引誘效果[24]。本試驗(yàn)篩選得到的活性組分中,α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯和β-石竹烯很可能會(huì)吸引松墨天牛進(jìn)行取食或產(chǎn)卵。此外,有研究表明,月桂烯可顯著吸引松墨天牛并且促進(jìn)其取食[25-26];在進(jìn)行松墨天牛的田間誘捕試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),(+)-3-蒈烯可誘捕到雌雄兩性天牛[27];與松墨天牛同屬于溝脛天牛亞科的云斑天牛(BatocerahorsfieldiHope)成蟲取食定位寄主野薔薇的特異成分為3-蒈烯[23]。由于昆蟲觸角電位反應(yīng)程度與揮發(fā)性化合物濃度有一定關(guān)系,雖然我們沒有篩選出月桂烯和3-蒈烯作為活性物質(zhì),但上述關(guān)于這兩種化合物組分的行為試驗(yàn)證明其是有相關(guān)研究?jī)r(jià)值的,因此,對(duì)于本試驗(yàn)中其他微量組分也可根據(jù)情況做進(jìn)一步探究。

從種間關(guān)系的角度考慮,小蠹蟲蛀干危害影響了樹體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸,導(dǎo)致樹脂分泌減少,這使得松墨天牛可以更好地取食松梢,兩物種存在一定的協(xié)作關(guān)系。松墨天牛作為松材線蟲的傳播媒介,在未達(dá)到性成熟時(shí)取食枝葉,體內(nèi)攜帶的松材線蟲便有機(jī)會(huì)通過取食的傷口進(jìn)入樹體危害,故本次試驗(yàn)針對(duì)未交配成蟲的活性物質(zhì)篩選能有效幫助誘捕成蟲,這將更有助于減少松材線蟲病的擴(kuò)散發(fā)生。雖然應(yīng)用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)幫助篩選出了這些活性成分,但目前仍無法確定它們對(duì)于天牛是產(chǎn)生吸引還是趨避作用。此外,未交配的雌雄成蟲在取食寄主時(shí)是否存在差異尚未確定。因此仍需要進(jìn)一步進(jìn)行行為試驗(yàn),以探究這些活性物質(zhì)的吸引或趨避作用,以及雌雄成蟲的取食選擇差異。

綜上所述,本次所收集并鑒定的受害馬尾松揮發(fā)性化合物中,假檸檬烯和右旋萜二烯兩種成分可能與小蠹危害有關(guān);而α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、莰烯、右旋萜二烯和β-石竹烯則可能在吸引天牛取食或產(chǎn)卵方面發(fā)揮重要作用。然而,對(duì)于假檸檬烯的作用有待進(jìn)一步探究。鑒于天牛在未性成熟時(shí)取食就可能導(dǎo)致松材線蟲病的傳播,今后的研究應(yīng)集中在如何利用揮發(fā)性化合物來吸引并刺激天牛進(jìn)行取食。隨后的室內(nèi)行為試驗(yàn)將進(jìn)一步篩選有效吸引未性成熟松墨天牛的物質(zhì)。