謝瀟瀟，趙青冬，胡凌云，姜淑芳，王曉萍，張文玲，李 珍，游艷琴，盧彥平

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心1婦產(chǎn)科，2臨檢科，北京100853

罕見的染色體三體（RATs）是指除21、18、13號染色體之外的常染色體三體，其嵌合體的發(fā)生機制可能是早期著床前胚胎配子減數(shù)分裂發(fā)生錯誤后三體/單體自救的結(jié)果，或有絲分裂階段染色體不分離導(dǎo)致［1-3］。罕見的染色體三體的真性嵌合在胎兒期并不多見，但隨著產(chǎn)前檢測技術(shù)的發(fā)展，已有越來越多的罕見染色體三體嵌合體被檢出。近幾年，非侵入性產(chǎn)前檢測技術(shù)（NIPT）的檢測范圍由傳統(tǒng)的常見染色體非整倍體逐漸拓展為全基因組檢測，由此檢測出更多的其他染色體異常，包括RATs，給后續(xù)的遺傳咨詢和處理帶來很多困難。2022年美國ACMG關(guān)于NIPT的指南認(rèn)為尚沒有足夠的證據(jù)支持NIPT常規(guī)用于RATs的篩查［4］，但也有研究發(fā)現(xiàn)NIPT檢測到的RATs與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，認(rèn)為NIPT是否有益于RATs的檢出，NIPT檢測到哪種RATs與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，以及嵌合體的百分比是否有助于妊娠風(fēng)險分層等問題仍需要更多臨床數(shù)據(jù)來進(jìn)一步評估［5-8］。本研究擬分析本院5年中通過NIPT檢出的RATs高風(fēng)險病例的產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局，評估NIPT對RATs的檢測價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月～2023年4月在我院建檔的或轉(zhuǎn)診至我院行非侵入性產(chǎn)前檢測提示為罕見的染色體三體高風(fēng)險的病例，向孕婦及家屬進(jìn)行產(chǎn)前咨詢后進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，根據(jù)檢測結(jié)果及超聲檢查進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢，所有病例隨訪妊娠結(jié)局。研究已獲得孕婦及其家人的知情同意，獲得倫理委員會批準(zhǔn)（S2019-112-01）。

1.2 染色體核型分析

在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺或臍血穿刺，留取羊水20 mL 或臍血2～3 mL，分別放入兩個無菌培養(yǎng)瓶中37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞后行G顯帶染色體核型分析。使用北昂醫(yī)藥公司的圖像分析軟件V4.20，鏡下分析5～10組核型，至少計數(shù)30組分裂相，分別來自兩個培養(yǎng)瓶的15個細(xì)胞克隆，細(xì)胞核型圖分析按照人類遺傳學(xué)國際命名法要求。

1.3 單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNParray）檢測及數(shù)據(jù)分析

留取7～10 mL羊水使用QIAamp DNA Mini Kit提取試劑盒（QIAGEN，德國）按照標(biāo)準(zhǔn)步驟提取DNA，并測定提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量。質(zhì)控合格（＞0.5 μg；A260/A280＞1.8；A260/A230＞1.5）的樣品用于后續(xù)SNP array。應(yīng)用CytoScan 750K Array Kit and Reagent Kit Bundle（Thermo Fisher Scientific）配套試劑和設(shè)備進(jìn)行染色體微陣列分析檢測，實驗流程包括：DNA 消化和連接、PCR擴增和純化、定量和片段化、標(biāo)記、微陣列雜交、洗染和掃描。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChAS 4.3（Thermo Fisher Scientific）軟件中進(jìn)行分析，在25 探針/50 Kb 為閾值進(jìn)行染色體拷貝數(shù)變異（CNV）結(jié)果的分析，一般報告≥100 Kb 的CNVs，≥10 Mb的雜合性的缺失（LOH）和20%以上的嵌合，參考數(shù)據(jù)庫包括UCSC、OMIM、DECIPHER、DGV、ClinGen和PubMed。

1.4 染色體拷貝數(shù)變異測序（CNV-seq）

留取10～15 mL羊水，使用核酸提取試劑盒（鄂漢械備20150250號），參考標(biāo)準(zhǔn)提取SOP進(jìn)行羊水DNA提取，并對提取質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，將提取的基因組DNA，通過酶切試劑將基因組DNA進(jìn)行打斷和末端修復(fù)加“A”，利用連接酶在DNA 兩端加上含標(biāo)簽序列的接頭，經(jīng)PCR擴增純化進(jìn)行片段選擇，完成單個患者的DNA建庫并質(zhì)控。利用BGISEQ-500測序平臺進(jìn)行測序，并利用測序儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件zebracall讀出原始測序數(shù)據(jù)。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化等步驟對數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，最后得到最終的CNV結(jié)果。下機數(shù)據(jù)使用SOAP比對到人類參考基因組（hg19）上，通過統(tǒng)計算法進(jìn)行CNV 變異分析，得到變異分析結(jié)果，結(jié)合OMIM、HGMD、DGV等數(shù)據(jù)庫對變異結(jié)果進(jìn)行解讀判定。

1.5 間期熒光原位雜交（FISH）

使用雅培公司的探針試劑盒，探針定位于7p11.1-q11.1（綠色）；2p11.1-q11.1（綠色）；14qte 14q32.3-（紅色）；3p11.1q11.1（紅色）；15p11.1q11.1（紅色）。取新鮮羊水10 mL，經(jīng)過離心固定后，根據(jù)探針數(shù)目確定雜交區(qū)，制片并烤片后進(jìn)行雜交與染色，鏡檢使用圖像分析軟件Cytovision，羊水病例每雜交區(qū)至少計數(shù)30個細(xì)胞；如遇到低比例嵌合情況需相應(yīng)加大計數(shù)。

1.6 非侵入性產(chǎn)前檢測（NIPT）

抽取5 mL 孕婦外周血經(jīng)雙重離心法處理得到DNA溶液。所得cfDNA質(zhì)控合格后，使用NIFTY?全因1.0試劑盒（華大基因）進(jìn)行文庫制備，將純化后的DNA文庫，進(jìn)行濃度質(zhì)控，質(zhì)控要求每個文庫＞2 ng/μL。將DNA文庫按比例混合準(zhǔn)備上機進(jìn)行測序，然后使用BGISEQ-500高通量測序儀進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和去接頭后，樣本下機fastq 數(shù)據(jù)與hg19 的人類參考基因組進(jìn)行比對，采用Z 檢驗判斷待檢樣本與正常樣本是否存在顯著性差異，來判斷是否存在染色體非整倍性。

2 結(jié)果

2.1 NIPT檢出的RATs的基本情況

共25282例孕婦進(jìn)行NIPT，檢出56例（0.22%）罕見的染色體三體高風(fēng)險，其中7號染色體檢出率最高（45%，25/56），其次為3號染色體（11%，6/56），2例病例同時存在兩種染色體三體高風(fēng)險（表1）。所有病例的平均年齡為31.8歲，其中34%（19/56）為高齡孕婦。經(jīng)過產(chǎn)前咨詢后，45例接受侵入性產(chǎn)前診斷，1例因胎死宮內(nèi)引產(chǎn)后進(jìn)行遺傳學(xué)檢測；52例已隨訪到妊娠結(jié)局，3例目前在妊娠期，1例失訪（圖1）。

圖1 NIPT檢出RATs高風(fēng)險病例基本情況Fig.1 High-risk cases of RATs detected by NIPT.

表1 NIPT檢出的RATs高風(fēng)險的病例數(shù)Tab.1 Number of high-risk cases of rare autosomal trisomies(RATs)detected by NIPT

2.2 胎兒真性嵌合病例及其妊娠結(jié)局

獲得遺傳學(xué)檢測結(jié)果的46例病例中，45例采集羊水進(jìn)行了染色體核型分析與染色體微缺失微重復(fù)檢測（SNParray/CNV-seq），1例引產(chǎn)后組織進(jìn)行染色體微缺失微重復(fù)檢測，懷疑胎兒真性嵌合的病例均經(jīng)過兩種以上的檢測方法進(jìn)行驗證。10例為胎兒真性嵌合病例（表2），陽性預(yù)測值（PPV）為22%（10/46），7號染色體胎兒真性嵌合PPV為10%（2/20）。足月分娩4例，隨訪新生兒結(jié)局良好（隨訪2月～3年），分別為T3嵌合2例、T7、T14嵌合各1例，嵌合比例6%～15%。5例選擇終止妊娠，分別為T2、T7、T10、T12、T15嵌合各1例（表2，病例1，5，7，8，10），嵌合比例16%～88%，其中T2、T10嵌合胎兒存在超聲結(jié)構(gòu)異常，分別為：T2嵌合胎兒“草莓頭“，雙膽囊，胎兒生長受限（FGR）；T10嵌合胎兒鼻骨缺失、唇裂、單臍動脈和心臟畸形；T15嵌合存在母源單親二體（UPD）（表2a）。1例T3低比例嵌合病例（1%～7%）仍在妊娠期（表2，病例4），超聲未見異常，咨詢后決定繼續(xù)妊娠。共6例獲得胎盤進(jìn)行驗證，均存在不同比例的嵌合細(xì)胞系（表2，病例1，3，5，6，9，10）。

表2 胎兒真性嵌合病例Tab.2 Data of cases of true fetal mosaicism

2.3 非真性嵌合病例及其妊娠結(jié)局

胎兒遺傳學(xué)檢測未發(fā)現(xiàn)嵌合細(xì)胞系的36例病例中，35例獲得妊娠結(jié)局，1例在妊娠期（表4，病例41）。35例獲得妊娠結(jié)局病例中27例妊娠結(jié)局良好，8例發(fā)生不良妊娠結(jié)局，分別為3、6、7、11、16號染色體異常。3號染色體異常病例（表4，病例34），因臍帶因素孕20周胎死宮內(nèi)。11號染色體異常病例（表4，病例43），孕25+2周超聲體質(zhì)量414g（＜P1），選擇致死性引產(chǎn)，胎盤驗證為44%T11限制性胎盤嵌合（CPM）。16號染色體異常的2例病例（表4，病例47，48）均發(fā)生嚴(yán)重的胎兒生長受限（體質(zhì)量＜P1），生后轉(zhuǎn)NICU；其中病例48孕34+5周合并重度子癇前期、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、肝功能損傷、胎盤早剝、凝血功能異常，緊急剖宮產(chǎn)終止妊娠，出生體質(zhì)量1680 g；病例47合并妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、肝功能損傷，37+4周剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量1550 g，此例胎盤驗證為完全性的T16 CPM。7號染色體異常的3例病例（表3，病例13，23，25）中，病例13孕30+5周因臍血流阻力增高、胎心減速緊急剖宮產(chǎn)，新生兒出生低體質(zhì)量1080 g（＜P1），合并尿道下裂，生后轉(zhuǎn)NICU，胎盤驗證存在14%T7；病例23孕35周無誘因胎盤早剝緊急剖宮產(chǎn)，生后轉(zhuǎn)NICU；病例25孕36周自發(fā)早產(chǎn)剖宮產(chǎn)。6號染色體異常病例（表4，病例39），合并妊娠期高血壓，38+2周因“羊水過少，胎心減速”緊急剖宮產(chǎn)，新生兒出生低體質(zhì)量2200 g（＜P1），生后轉(zhuǎn)NICU。不良妊娠結(jié)局比例23%（8/35）。

表3 NIPT檢出T7高風(fēng)險病例的遺傳學(xué)檢測結(jié)果及妊娠結(jié)局Tab.3 Genetic results and pregnancy outcomes of cases with T7 high-risk detected by NIPT

表4 NIPT檢出其他RATs高風(fēng)險病例的遺傳學(xué)檢測結(jié)果及妊娠結(jié)局Tab.4 Genetic results and pregnancy outcomes of cases with other RATs high-risk detected by NIPT

2.4 未獲得遺傳學(xué)結(jié)果的病例及其妊娠結(jié)局

未獲得遺傳學(xué)檢測結(jié)果共10例，8例獲得妊娠結(jié)局，其中1例同時存在3號和7號染色體異常（表4，病例56）合并輕度子癇前期，35+5周早產(chǎn)，新生兒體質(zhì)量2550 g，生后轉(zhuǎn)NICU，另1例7號染色體異常（表3，病例31）咨詢后選擇直接致死性引產(chǎn)，余6例妊娠結(jié)局良好。

3 討論

NIPT是基于母血中的胎兒游離DNA（cfDNA）片段的非侵入性產(chǎn)前檢測，目前在臨床上廣泛應(yīng)用于常見的染色體非整倍體的篩查，隨著生物信息學(xué)算法的不斷改進(jìn)，NIPT篩查范圍逐漸擴展至全基因組檢測，因此檢出了更多的其他染色體異常，其中包括罕見的染色體非整倍體［7,9］。罕見的染色體完全三體一般在孕早期胚胎停育或流產(chǎn)［10］，因此，孕中期NIPT檢出的RATs高風(fēng)險病例通常為嵌合體。染色體三體嵌合體包括胎兒真性嵌合體（TFM）和CPM。母血中的cfDNA片段來自于凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞，其來源與絨毛細(xì)胞相似，因此NIPT可以反映細(xì)胞滋養(yǎng)層的遺傳結(jié)構(gòu)［9,11,12］，但無法區(qū)分TFM和CPM，只能通過侵入性產(chǎn)前檢測來明確。目前評估NIPT對罕見的染色體三體嵌合體的檢測價值的研究較少。

本研究總結(jié)了本院近5年NIPT檢測出的RATs高風(fēng)險的數(shù)據(jù)，RATs 檢出率為0.22%，較Zhang 等［13］（0.36%）及Raymond等［14］（0.39%）的研究略低；檢出異常的染色體包括2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20，其中7號染色體檢出例數(shù)最多（45%），與其他研究的結(jié)果相似［6,13,14］，其次為3號染色體11%，其余染色體檢出病例數(shù)不多，1、4、17、19號染色體未檢出；多數(shù)病例檢出一種染色體異常，也有少數(shù)病例同時檢出兩種染色體異常。獲得胎兒遺傳學(xué)檢測結(jié)果的46例中，TFM共10例，PPV為22%，顯著低于常見的染色體21、18、13三體的PPV［4,12］。本研究共獲得10例胎盤進(jìn)行多點驗證，其中6例TFM病例，4例非TFM病例，結(jié)果均提示胎盤存在不同比例的嵌合細(xì)胞系，證實了NIPT對于胎盤中存在的罕見染色體三體嵌合具有一定的檢測效能，因此，當(dāng)侵入性產(chǎn)前診斷未提示TFM時，存在CPM的可能性較大，這也可以解釋研究中RATs 陽性預(yù)測值較低的現(xiàn)象。

RATs的TFM比較罕見，其臨床結(jié)局的嚴(yán)重程度因嵌合發(fā)生的時間、發(fā)生的部位、在關(guān)鍵組織中的分布、印記基因以及異常細(xì)胞的數(shù)量不同而不同［1,15］。在產(chǎn)前診斷中，可以使用多種檢測手段檢測樣本的嵌合細(xì)胞比例，本研究10例TFM均使用兩種以上的檢測方法進(jìn)行驗證，妊娠結(jié)局良好的4例病例均為低比例嵌合，超聲未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)過充分的產(chǎn)前咨詢后選擇繼續(xù)妊娠，隨訪妊娠結(jié)局良好，而不良妊娠結(jié)局的發(fā)生主要與超聲異常和UPD相關(guān)；6例留取胎盤進(jìn)行檢測，證實均存在胎盤嵌合。本研究檢出的真性嵌合病例50%為沒有高危因素的低齡孕婦，因此NIPT能夠在一定程度上增加沒有高危因素孕婦的TFM的檢出。在本研究中雖然獲得良好妊娠結(jié)局的均為低比例嵌合病例，但產(chǎn)前能夠獲得的胎兒樣本來源非常有限，因此不能僅用嵌合比例來判斷胎兒表型的嚴(yán)重程度及預(yù)后，此類病例需結(jié)合有經(jīng)驗的超聲科醫(yī)生的產(chǎn)前超聲篩查進(jìn)行評估，并對孕婦及家屬進(jìn)行充分而慎重的產(chǎn)前咨詢后進(jìn)行決策。

Zhang等［13］對97例RATs假陽性的病例中的81例進(jìn)行了隨訪，37例發(fā)生不良妊娠結(jié)局，其中小于胎齡兒、生長受限和早產(chǎn)的發(fā)生率較高。Lin等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NIPT顯示16-三體、22-三體、9-三體和2-三體的孕婦發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險更高，包括早產(chǎn)、流產(chǎn)和超聲異常。Xiang等［16］的研究也認(rèn)為，RATs假陽性的病例仍處于不良妊娠結(jié)局的高風(fēng)險中，特別是NIPT顯示16三體和15三體的孕婦。本研究中除真性嵌合之外的病例共43例獲得妊娠結(jié)局，發(fā)生不良妊娠結(jié)局10例，發(fā)生率為23%，6例新生兒生后轉(zhuǎn)NICU治療。最常見的為胎兒生長受限（FGR），共7例，且程度均較重，見于6、7、11、16號染色體異常，其中5例體質(zhì)量小于第一百分位數(shù)；最早出現(xiàn)嚴(yán)重FGR的為T11 CPM的病例，孕22+5周胎兒體質(zhì)量即小于P1，孕婦選擇致死性引產(chǎn)。5例病例早產(chǎn)，其中自發(fā)性早產(chǎn)1例（7號染色體），治療性早產(chǎn)4例，7例活產(chǎn)病例均行剖宮產(chǎn)終止妊娠，其中緊急剖宮產(chǎn)4例（6、7、16號染色體），孕周最小的一例為T7 CPM的病例，孕30+5周即因出現(xiàn)嚴(yán)重的胎盤功能下降，F(xiàn)GR、胎心減速而行緊急剖宮產(chǎn)終止妊娠。5例病例發(fā)生妊娠期合并癥或并發(fā)癥，如妊娠期高血壓疾病、肝功能損傷、胎盤早剝等，見于6、7、16號染色體，以及1例3、7號兩種染色體異常病例。既往已有不少研究發(fā)現(xiàn)，T16 CPM病例通常與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，常見FGR、胎兒結(jié)構(gòu)性異常及先兆子癇［17-19］。本研究2例16號染色體異常病例除發(fā)生FGR，孕晚期均出現(xiàn)母體肝功能損傷，膽汁酸升高，其中1例孕37+4周剖宮產(chǎn)，胎盤驗證為T16 CPM，另一例病例孕33+2周時出現(xiàn)肝功能損傷未重視，孕34+5周重度子癇前期，發(fā)生胎盤早剝及凝血功能異常而行緊急剖宮產(chǎn)，但此例未獲得胎盤組織，不排除與T16 CPM有關(guān)。CPM引起不良妊娠結(jié)局的機制還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)CPM中胎盤梗死和蛻膜血管變化的比例與正常胎盤相比幾乎翻倍，認(rèn)為可能是染色體異常導(dǎo)致胎盤局部功能失調(diào)［20］。與普通孕婦人群相比，CPM病例子癇前期和低出生體質(zhì)量的風(fēng)險顯著增加，且排除T16 CPM之后仍具有顯著意義［21］。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)，雖然NIPT對于TFM的檢測PPV不高，但NIPT提示罕見染色體異常的病例仍有可能發(fā)生較嚴(yán)重的妊娠合并癥或并發(fā)癥，尤其是存在CPM時，較常見的為FGR和早產(chǎn)，F(xiàn)GR常為首發(fā)表現(xiàn)，因此，對于此類病例需重視和加強妊娠期的監(jiān)測與管理，及時干預(yù)。

在既往多項研究中，7號染色體異常是NIPT檢測中最常檢出的罕見的染色體非整倍體異常，本研究中亦是7號染色體異常病例檢出最多，近一半（45%）的RATs高風(fēng)險病例均為7號染色體，篩查陽性率為0.099%，但PPV僅為10%，隨訪完整的22例中，82%病例妊娠結(jié)局良好。7號染色體攜帶印記基因，如果三體是減數(shù)分裂錯誤導(dǎo)致，三體自救后可能存在UPD而影響新生兒預(yù)后［22-24］。然而，在Benn等［25］的研究中，93例CPM7沒有一例檢出UPD7，Zhu等［26］的研究也認(rèn)為，大多數(shù)7號嵌合三體形成的原因不是三體自救，胎兒存在UPD7的風(fēng)險低。本研究未能對所有7號染色體三體高風(fēng)險的病例進(jìn)行UPD檢測，僅在活產(chǎn)的1例T7 TFM病例和1例T7 CPM病例中排除了UPD7，活產(chǎn)的21例新生兒均未發(fā)現(xiàn)UPD7相關(guān)異常表現(xiàn)。

本研究中進(jìn)行侵入性產(chǎn)前檢測的病例年齡小于35歲約占67%，NIPT在一定程度上增加了低危孕婦侵入性產(chǎn)前檢測的需求，而且，NIPT檢測結(jié)果給孕婦及其家庭帶來的心理焦慮不容忽視［27］，本研究有1例孕婦僅因NIPT結(jié)果提示7號染色體異常而自行直接選擇孕中期致死性引產(chǎn)。因此，對于NIPT檢出RATs高風(fēng)險的結(jié)果的咨詢需謹(jǐn)慎，且還需要更多的研究來權(quán)衡侵入性產(chǎn)前檢測對于此類病例的利弊。

綜上所述，非侵入性產(chǎn)前檢測技術(shù)的發(fā)展增加了胎兒罕見染色體三體真性嵌合病例的檢出，在一定程度上避免了此類缺陷兒的出生，但陽性預(yù)測值不高，與限制性胎盤嵌合現(xiàn)象有關(guān)。當(dāng)侵入性產(chǎn)前檢測未提示胎兒存在嵌合細(xì)胞系，大部分病例預(yù)后良好，尤其是7號染色體，但仍有發(fā)生母兒不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險，最常見為FGR及早產(chǎn)，F(xiàn)GR常為首發(fā)表現(xiàn)。因此，當(dāng)NIPT檢出RAT高風(fēng)險，應(yīng)向孕婦進(jìn)行相應(yīng)的產(chǎn)前咨詢以減輕其焦慮，同時結(jié)合侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果及超聲隨訪對胎兒預(yù)后進(jìn)行評估，加強妊娠期監(jiān)測和管理能夠使這部分孕婦獲益；對于未行NIPT的孕婦，孕中晚期發(fā)現(xiàn)FGR，如侵入性產(chǎn)前檢測未提示異常，可以補充NIPT 協(xié)助查找FGR原因。