李明霞,楊謙,喬海霞,王曉玲,賈麗媛,胡利梅,任衛(wèi)東

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,張家口 075000;2.河北北方學(xué)院,張家口 075000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一,其特點(diǎn)是一系列異常病理改變,包括腎小球肥大、系膜增生、腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)積聚[1-2]。足細(xì)胞是腎小球毛細(xì)血管過濾的重要組成部分之一,越來越多的證據(jù)表明,由足細(xì)胞的異常凋亡與自噬受阻引起的細(xì)胞損傷與DN的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[3]。因此,研究足細(xì)胞的損傷對于揭示DN的發(fā)生和發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。淫羊藿苷是淫羊藿提取物,屬黃酮類化合物,可用于治療腎病。淫羊藿苷可通過減輕大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激水平,減少細(xì)胞外基質(zhì)的增生并抑制腎組織細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮對DN大鼠腎功能的保護(hù)作用[4];哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,CREB)通路的激活可抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)自噬,從而發(fā)揮對粘菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的拮抗作用[5]。但淫羊藿苷能否通過調(diào)控mTOR/Akt/CREB通路來影響足細(xì)胞損傷介導(dǎo)的DN發(fā)生尚不可知,因此,本研究通過構(gòu)建高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型,以探討淫羊藿苷對高糖狀態(tài)下足細(xì)胞自噬、凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 小鼠足細(xì)胞MPC5購自上海酶研生物科技有限公司,批號:C20527。

1.2主要藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷購自北京百靈威科技有限公司(原料藥,含量≥98%,貨號:CL417-30-5);mTOR抑制劑購自上海金穗生物科技有限公司(GDC-0349,貨號:CAL-6317);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,貨號JT1167K)、RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號:JT2912K)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,貨號:JT3612K)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(貨號:JT50073)均購自鄭州金圖生物科技有限公司;吖啶橙(貨號:JPS0907)、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC,貨號:JP19125)、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒(貨號:JP70134)均購自碧云天生物科技有限公司;兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)II(貨號:ab10651)、LC3Ⅰ(貨號:ab10659)、自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1,貨號:ab10653)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax)(貨號:ab20637)、Bcl-2(貨號:ab20640)、磷酸化mTOR(p-mTOR,貨號:ab36711)、磷酸化Akt(p-Akt,貨號:ab36814)、磷酸化CREB(p-CREB,貨號:ab39521)、mTOR(貨號:ab36712)、Akt(貨號:ab36817)、CREB(貨號:ab39524)、GAPDH(貨號:ab19174)一抗,羊抗兔二抗(貨號:ab05237)均購自美國Abcam公司;酶標(biāo)儀(型號:DR3506)、凝膠成像儀(型號:EL-4900)均購自上海書俊儀器設(shè)備有限公司;熒光顯微鏡(型號:800TFL)、流式細(xì)胞儀(型號:FC800)均購自上海益鳴生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將MPC5細(xì)胞置于含有10% FBS、10 U·mL-1重組小鼠干擾素(interferon,IFN)-γ的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在33 ℃、5%二氧化碳(CO2)和相對濕度95%下進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。為了刺激細(xì)胞分化,將傳代后的MPC5細(xì)胞在含有10% FBS且不含小鼠IFN-γ的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)14 d,使其分化成熟并達(dá)到80%～90%的融合,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

依據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)濃度,將MPC5細(xì)胞分為5組:正常對照組(5.5 mmol·L-1葡萄糖)[6]、高糖組(30 mmol·L-1葡萄糖)[6]、淫羊藿苷組(30 mmol·L-1葡萄糖+5 μmol·L-1淫羊藿苷)[7]、GDC-0349組(30 mmol·L-1葡萄糖+50 μmol·L-1GDC-0349)[8]、淫羊藿苷+GDC-0349組(30 mmol·L-1葡萄糖+5 μmol·L-1淫羊藿苷+50 μmol·L-1GDC-0349)。各組按上述濃度要求向RPMI 1640培養(yǎng)基中添加相應(yīng)試劑或者藥物,培養(yǎng)48 h后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.4MTT法檢測MPC5細(xì)胞活力 將MPC5細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種到96孔板中,按照“1.3節(jié)”中的分組分別處理48 h后,將MTT溶液20 μL添加到每個(gè)孔中,并在37 ℃下再孵育4 h。使用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的吸光度(A570),計(jì)算細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=各處理組A570/正常對照組A570×100%)。

1.5吖啶橙染色觀察MPC5細(xì)胞的自噬情況 收集“1.3節(jié)”中處理48 h的5組MPC5細(xì)胞,取等量各組MPC5細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至含6 μg·mL-1吖啶橙的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 min,收集細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗3次,利用熒光顯微鏡觀察各組MPC5細(xì)胞的自噬情況。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC5細(xì)胞凋亡 收集上述“1.3節(jié)”中處理48 h的5組MPC5細(xì)胞,按照每孔4×105個(gè)的濃度接種到6孔培養(yǎng)板中,用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞15 min后將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中。然后向每孔中加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL,室溫下避光孵育15 min,利用流式細(xì)胞術(shù)分析MPC5細(xì)胞凋亡情況。

1.7蛋白印跡法檢測MPC5細(xì)胞自噬(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1)及凋亡(Bax、Bcl-2)和mTOR/Akt/CREB通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將5組MPC5細(xì)胞用PBS洗滌2次后,在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中裂解,裂解物以10 000 r·min-1(r=8 cm)、4 ℃離心15 min,收集上清液。BCA試劑盒用于測量蛋白質(zhì)濃度,通過凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后,分別加入一抗抗體LC3Ⅱ(1：1 000)、LC3Ⅰ(1：1 000)、Beclin-1(1：1 000)、Bax(1：2 000)、Bcl-2(1：2 000)、p-mTOR(1：2 000)、p-Akt(1：1 000)、p-CREB(1：1 000)、mTOR(1：2 000)、Akt(1：1 000)、CREB(1：1 000)、GAPDH(1：2 000)4 ℃下孵育過夜,次日,用TBST洗滌3次,然后與羊抗兔二抗(1：2 000)在室溫下孵育1 h。通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對蛋白條帶的顯色情況進(jìn)行檢測,以ImageJ軟件對蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.15組MPC5細(xì)胞活力比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞活力顯著降低(q=29.204,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞活力顯著升高(q=19.641,P<0.05),GDC-0349組MPC5細(xì)胞活力顯著降低(q=7.769,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞活力顯著降低(q=27.410,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞活力顯著升高(q=8.132,P<0.05);見表1。

表1 5組MPC5細(xì)胞活力比較

2.25組MPC5細(xì)胞吖啶橙染色比較 正常對照組MPC5細(xì)胞自噬體呈現(xiàn)出正常的亮綠色熒光;與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞自噬能力增強(qiáng),自噬體表現(xiàn)出橙色熒光;與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞自噬能力進(jìn)一步增強(qiáng),自噬體數(shù)量增多,自噬體呈現(xiàn)出磚紅色熒光,GDC-0349組MPC5細(xì)胞自噬能力減弱,自噬體數(shù)量減少,自噬體表現(xiàn)出橙色熒光;與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞自噬能力減弱,自噬體數(shù)量減少,自噬體表現(xiàn)出橙色熒光;與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞自噬能力增強(qiáng),自噬體表現(xiàn)出橙色熒光。見圖1。

圖1 吖啶橙染色檢測MPC5細(xì)胞自噬(×200)

2.35組MPC5細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著升高(q=11.436,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著降低(q=8.899,P<0.05),GDC-0349組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著升高(q=6.713,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著升高(q=15.611、7.599,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著降低(q=8.012,P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC5細(xì)胞凋亡

表2 5組MPC5細(xì)胞凋亡率比較

2.45組MPC5細(xì)胞自噬(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1)、凋亡(Bax、Bcl-2)相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(q=6.480～23.307,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低(q=6.465～13.162,P<0.05),GDC-0349組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(q=5.758～12.930,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(q=6.263～18.239,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(q=5.888～13.132,P<0.05)。見圖3和表3。

A.正常對照組;B.高糖組;C.淫羊藿苷組;D.GDC-0349組;E.淫羊藿苷+GDC-0349組。

表3 5組MPC5細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

2.55組MPC5細(xì)胞mTOR/Akt/CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白的表達(dá)水平顯著降低(q=7.034～11.068,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平顯著升高(q=5.336～6.008,P<0.05),GDC-0349組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平顯著降低(q=8.246～11.700,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平顯著降低(q=4.608～17.709,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平顯著升高(q=8.974～10.752,P<0.05);見表4和圖4。

A.正常對照組;B.高糖組;C.淫羊藿苷組;D.GDC-0349組;E.淫羊藿苷+GDC-0349組。

表4 5組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

DN的臨床特征表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿升高、腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)聚集,導(dǎo)致自噬流抑制、足細(xì)胞損傷進(jìn)而促進(jìn)腎功能障礙[9-10]。然而,足細(xì)胞損傷介導(dǎo)的DN的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,并且缺乏DN的治療策略。研究表明,足細(xì)胞自噬主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解,調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài),其功能障礙是足細(xì)胞損傷的重要誘導(dǎo)因素[11];短時(shí)間內(nèi)的高糖處理可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬,而隨著葡萄糖干預(yù)時(shí)間的延長,自噬水平降低[12];DN中足細(xì)胞的增殖和再生是有限的,其異常凋亡與DN的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果顯示,與正常對照組比較,高糖組MPC5細(xì)胞活力降低,自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞凋亡率升高,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低,提示高糖組MPC5細(xì)胞自噬及凋亡能力增強(qiáng),表明高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

淫羊藿苷具有保護(hù)神經(jīng)元免受損傷、改善骨質(zhì)疏松、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、抗氧化等多種生物活性[15]。張穎等[16]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能改善DN大鼠腎動(dòng)脈舒縮功能。WANG等[17]報(bào)道淫羊藿苷可減輕高糖誘導(dǎo)的DN大鼠和腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。MI等[18]報(bào)道淫羊藿苷通過抑制細(xì)胞凋亡和激活自噬來預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。但淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬及凋亡的影響筆者尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞活力升高,自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞凋亡率降低,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平升高,促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平降低,提示淫羊藿苷可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬并抑制細(xì)胞凋亡,減輕細(xì)胞損傷。

mTOR信號通路是一條經(jīng)典的調(diào)控自噬凋亡信號通路,在細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用[19]。研究表明,mTOR在多條信號通路中位于核心位置,其可通過激活下游Akt/CREB通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5,20]。ZHANG等[21]研究表明,激活A(yù)kt/CREB通路可防止高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性;OU等[22]研究顯示,激活A(yù)kt/CREB通路可防止氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果顯示,高糖組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平均低于正常對照組,表明mTOR/Akt/CREB通路在高糖條件下處于抑制狀態(tài)。而淫羊藿苷組MPC5細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平顯著高于高糖組,推測淫羊藿苷可能通過激活mTOR/Akt/CREB通路促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬及抑制細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測,本研究設(shè)置mTOR/Akt/CREB通路抑制劑GDC-0349進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,與高糖組和淫羊藿苷組比較,GDC-0349組MPC5細(xì)胞活力降低,自噬體數(shù)量減少,細(xì)胞凋亡率升高,促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低,表明GDC-0349抑制mTOR/Akt/CREB通路后,可加重高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷。而淫羊藿苷+GDC-0349可逆轉(zhuǎn)淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)MPC5細(xì)胞的作用效果,進(jìn)一步證明了淫羊藿苷通過激活mTOR/Akt/CREB通路促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。

綜上所述,淫羊藿苷可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡,該機(jī)制與激活mTOR/Akt/CREB通路有關(guān)。但關(guān)于淫羊藿苷調(diào)控高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞自噬及凋亡的作用機(jī)制較多,有待進(jìn)一步研究。