肖孟勇,駱亞莉,3△,齊曉風,周 雯,周世琴,劉 凱,安方玉,劉永琦,3

(1.甘肅中醫(yī)藥大學,蘭州 730000;2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室,蘭州 730000;3.甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點實驗室,蘭州 730000)

缺血缺氧廣泛存在于多種臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,可引起全身組織器官的損傷,目前缺乏有效的治療手段。鐵死亡是一種鐵依賴性調(diào)控性細胞死亡方式,胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和氧化應(yīng)激等途徑是鐵死亡發(fā)生的重要分子機制[1]。目前鐵死亡研究還處于初期階段,臨床研究及應(yīng)用更為鮮見。近年研究證實,鐵死亡參與缺血缺氧性疾病的發(fā)展過程。線粒體破壞是鐵死亡的典型形態(tài)學改變。中醫(yī)藏象實質(zhì)細胞生物學假說認為,線粒體與中醫(yī)脾為“氣血生化之源”所行使的功能相通[2]。中醫(yī)藥具有多點起效、安全廉價的特點,在調(diào)節(jié)鐵死亡方面具有明顯優(yōu)勢,加快相關(guān)中藥研發(fā)具有重要意義。本文歸納近年來中醫(yī)藥抑制鐵死亡防治缺血缺氧性疾病的相關(guān)文獻,以期為基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的方向及理論支持。

1 鐵死亡概述

鐵死亡是一種不同于凋亡、壞死和自噬的新型細胞死亡方式,細胞線粒體表現(xiàn)為皺縮狀態(tài),線粒體嵴減少或消失。2003年,美國Sonam D研究團隊在研究誘導(dǎo)致癌基因RAS突變導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的作用機制時,發(fā)現(xiàn)這種異于凋亡的細胞死亡過程[3]。2012年,Dixon等[4]將鐵依賴性脂質(zhì)過氧化、活性氧(reactive oxygen species, ROS)堆積、P53介導(dǎo)的細胞死亡命名為鐵死亡。鐵蓄積是鐵死亡的必要條件,鐵死亡參與炎癥、心血管等疾病的病理改變[5-6]。

2 鐵死亡相關(guān)機制研究進展

2.1 胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(membrane Na+-dependent cystine / glutamate reverse transporter,System Xc-)與細胞對鐵死亡的敏感性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)抑制此系統(tǒng)可導(dǎo)致細胞半胱氨酸(cysteine, Cys)或谷胱甘肽(glutathione, GSH)消耗,破壞細胞氧化還原穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致鐵死亡[7]。胱氨酸(cystine, Cys-Cys)通過System Xc-進入到細胞內(nèi)并被還原為Cys,參與GSH的合成,谷氨酸(glutamic acid, Glu)以1:1的比例交換Cys-Cys,因此Glu水平會影響System Xc-的功能[8]。Glu升高會抑制System Xc-的活性并阻止Cys-Cys的攝取,引起鐵死亡。System Xc-在阻止脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)揮顯著作用。

2.2 核因子-紅細胞-2相關(guān)因子2

核因子-紅細胞-2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2 related factor, Nrf)2是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,其下游靶基因參與阻止細胞中的氧化還原失衡。Nrf2可以被p62-Keap1相互作用激活,與鐵和抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的抗氧化反應(yīng)原件(anti-oxidative response element, ARE)同時增加[9]。氧化刺激條件下,Nrf2反式激活選擇性自噬接頭蛋白(sequestosome, SQSTM)1編碼p62蛋白,p62積累促進Keap1的p62依賴性自噬降解,進而抑制Keap1介導(dǎo)的Nrf2降解[10]。Nrf2是由Keap1介導(dǎo)經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解的。實驗證明,Nrf2激活劑可以預(yù)防鐵死亡誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變[11]。綜上,Nrf2調(diào)控因子在鐵死亡中的作用不容忽視。

2.3 谷胱甘肽過氧化物酶4

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX) 4是一種細胞內(nèi)硒蛋白抗氧化酶。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)GSH的缺失會導(dǎo)致GPX4酶的失活,GPX4的敲低或者過表達可以調(diào)節(jié)鐵死亡誘導(dǎo)劑的致死率。GPX4和鐵死亡抑制蛋白(ferroptosis suppressor protein, FSP)1可以清除脂質(zhì)ROS。GPX4是哺乳動物細胞中唯一負責磷脂氫過氧化物 (phospholipid hydroperoxide, PLOOH)還原的酶,且能抑制花生四烯酸活化,在保護細胞免受氧化損傷方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13]。豆類蛋白酶促進分子伴侶介導(dǎo)的GPX4自噬,可以促進腎小管細胞鐵死亡[14]。因此GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。鐵死亡的分子機制見圖1。

圖1 鐵死亡的分子機制

2.4 鐵代謝

鐵的吸收、利用平衡中斷,亞鐵離子Fe2+積累會催化Fenton反應(yīng)。鐵代謝關(guān)鍵蛋白有鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, TF)、二價金屬轉(zhuǎn)運體(divalentmetal-ion transporter, DMT)1及溶質(zhì)載體蛋白7家族成員(solute carrier family 7 member, SLC7A)11。SLC7A11的功能是輸入Cys-Cys進行GSH生物合成和抗氧化,其過表達可以抑制鐵死亡[15]。p53能夠抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄間接激活脂氧合酶(lipoxidase, ALOX)12的功能,導(dǎo)致ROS應(yīng)激時發(fā)生ALOX12依賴性鐵死亡[16]。

2.5 脂質(zhì)過氧化

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)是鐵死亡過程中最易受過氧化影響的脂質(zhì)。磷酸化酶激酶γ(phosphorylase kinaseγ, PHKG)2調(diào)節(jié)ALOX,進而通過雙烯丙基位置的 PUFA的過氧化作用驅(qū)動鐵死亡[17]。ALOX可以使PUFA與氧自由基結(jié)合生成脂質(zhì)過氧化物[18]。ALOX在脂質(zhì)過氧化中扮演著重要的角色。

3 缺血缺氧與鐵死亡

缺血缺氧可以引起全身各組織器官的損傷。在低氧條件下,抗氧化蛋白Sestrin2可通過Nrf2通路減少ROS的生成發(fā)揮保護作用[19]。在缺血缺氧狀態(tài)下,微環(huán)境會釋放大量有毒物質(zhì)、炎癥遞質(zhì)及促凋亡因子,如促凋亡基因Bax、T淋巴細胞及趨化因子等。有研究顯示,鐵死亡與缺血缺氧所致多器官缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)相關(guān)[20]。

3.1 心腦血管疾病與鐵死亡

心肌細胞和神經(jīng)元死亡涉及包括鐵死亡在內(nèi)的多種機制。缺氧的心肌細胞ROS含量顯著增加。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的過度表達可以抑制ROS的產(chǎn)生,保護心肌細胞免受鐵蓄積和鐵死亡的影響[21]。mTOR的下游效應(yīng)器核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein s6 kinase, S6K)1和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(eukaryotic translation initiation factor 4e binding protein, 4EBP)1可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生成和細胞周期,恢復(fù)心肌梗死的心室功能[22]。另外,血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)-1上調(diào)可降解血紅素并釋放心肌細胞中的游離鐵,導(dǎo)致線粒體鐵超載和脂質(zhì)過氧化,引起心肌細胞鐵死亡[23]。

腦卒中也存在鐵死亡現(xiàn)象。?；o酶A合成酶長鏈家族成員(acyl-CoA synthetase long chain family member, ACSL)4可增強脂質(zhì)過氧化促進鐵死亡,還能促進膠質(zhì)細胞產(chǎn)生促炎性細胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白細胞介素(interleukin, IL)-6和IL-1β。在腦缺血早期,缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1α可調(diào)節(jié)氧糖剝奪(oxygen-glucosedeprivation, OGD)降低ACSL4的表達[24]。ACSL4過表達會引起氧化還原反應(yīng)失衡,釋放大量ROS,進一步加重炎癥反應(yīng)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、GSH組成機體的抗氧化系統(tǒng),GSH可激活下游信號分子GPX4,抑制脂質(zhì)過氧化,抗氧化系統(tǒng)受損會促進鐵死亡。鐵死亡在心腦血管疾病中的作用機制見圖2。

圖2 鐵死亡在心腦血管疾病中的作用機制

3.2 呼吸系統(tǒng)疾病與鐵死亡

呼吸系統(tǒng)疾病中鐵死亡相關(guān)研究多集中在腫瘤疾病[25-26]。急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)相關(guān)研究較少。在油酸誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中,肺泡Ⅱ型上皮細胞出現(xiàn)線粒體皺縮和線粒體膜破裂,丙二醇(malondialdehyde, MDA)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase, PTGS)2上調(diào),鐵蛋白、GSH、GPX4降低,肺細胞內(nèi)鐵含量增多[27]。鐵過量可發(fā)生Fendon反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS,加劇氧化損傷,進一步促進IL-1β、TNF-α等炎癥因子和MDA、4-羥基壬烯醛等毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生[28]。當外來病原體入侵時也會誘導(dǎo)炎性免疫反應(yīng),產(chǎn)生不同的細胞因子、趨化因子、干擾素、ROS等,參與肺部炎癥反應(yīng)。鐵死亡在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用機制見圖3。

圖3 鐵死亡在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用機制

西醫(yī)治療缺血缺氧性疾病主要采用的方法有強心、利尿、擴血管、機械通氣、改善微循環(huán)等,在一定程度上可糾正缺血缺氧,但是對于慢性持續(xù)存在的缺血缺氧相關(guān)疾病如肺纖維化、慢性心力衰竭、腦梗死等療效有限。研究顯示,鐵死亡參與缺血缺氧性疾病的發(fā)展,鐵死亡抑制劑的開發(fā)可能為缺血缺氧性疾病治療提供新的思路。目前,鐵死亡抑制劑主要有鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine, DFO)、去鐵酮(deferiprone, DFP)及地拉羅司(deferasirox, DFX);抗氧化劑Trolox、GSH、ferrostatin-1及N-乙酰半胱氨酸這2類。有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),DFP易致粒細胞缺乏癥等不良反應(yīng)[29]。由于鐵死亡機制未完全闡明,鐵死亡抑制劑尚未在臨床中廣泛應(yīng)用。然而中藥具有多靶點、協(xié)同增效、安全等優(yōu)勢,因此開發(fā)抑制鐵死亡的天然藥物具有重要意義。

4 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)鐵死亡防治缺血缺氧性疾病

4.1 基于中醫(yī)氣血理論對鐵死亡的認識

鐵死亡主要發(fā)生在線粒體中,以線粒體破壞為標志性特征,線粒體是調(diào)節(jié)鐵和產(chǎn)生ROS的主要細胞器。線粒體是真核細胞腺苷三磷酸(adenosine 5'-triphosphate,ATP)的生產(chǎn)基地,與氣血生化之源“脾”有著共通之處[30]。線粒體損傷會引起機體功能低下,這與脾虛所致肢體倦怠、神疲乏力癥狀十分契合。劉友章教授于1991年首次提出“中醫(yī)脾-線粒體”假說[31],線粒體能量代謝障礙是脾虛病機的生物學表現(xiàn)之一。因此鐵死亡與脾虛關(guān)系密切。腎為先天之本,主納氣;脾為后天之本,主氣血生化。先天得后天之充養(yǎng),后天得先天之資助,相互資生、相互促進而生生不息[32]。脾虛損及腎臟會引起缺血缺氧性疾病的發(fā)生,健脾益氣、調(diào)理氣血可以為調(diào)節(jié)鐵死亡防治缺血缺氧性疾病提供新的見解。

氣血屬于陰陽的范疇,所謂“陰陽為綱,氣血為本”。相關(guān)研究表明中藥復(fù)方、中藥活性成分均可以調(diào)節(jié)鐵死亡,提示調(diào)控鐵死亡可能是中醫(yī)藥治療多種疾病的重要機制,總體原則為調(diào)整陰陽[33]。同陰陽交感、消長、對立制約的恒動過程相似,生命、疾病一直處于“漲落”的動態(tài)變化中。如細胞增殖、凋亡正是在人體陰陽的調(diào)控下有序進行,一旦陰陽失衡,就會出現(xiàn)疾病。中醫(yī)理論認為凡運動、上升、興奮屬陽;相對靜止、下降、抑制屬陰。鐵死亡(陰)是細胞死亡的特殊形式。鐵死亡抑制劑旨在調(diào)整陰陽,抑制鐵死亡可保護正常組織免受傷害,相當于中醫(yī)的抑陰扶陽理論。中醫(yī)氣血理論對鐵死亡的認識見圖4。

圖4 中醫(yī)氣血理論對鐵死亡的認識

4.2 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)鐵死亡防治心腦血管疾病

4.2.1 中藥活性成分抑制鐵死亡 目前有關(guān)研究表明,中藥活性成分可通過抑制鐵死亡防治心血管疾病。研究證實,丹參酮ⅡA可激活Nrf2通路抑制冠狀動脈內(nèi)皮細胞發(fā)生鐵死亡,為動脈粥樣硬化疾病治療提供了新的思路[34]。另有研究發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷可以通過激活Nrf2信號通路、增加GPX4的表達抑制鐵死亡,從而減弱心肌病帶來的損害[35]。紅花黃色素可以抑制Fe2+和ROS的積累,逆轉(zhuǎn)血清中GSH、SOD和MDA水平[36]。黃芩苷可以清除腦組織內(nèi)鐵沉積,減少ROS的產(chǎn)生,發(fā)揮對腦出血模型小鼠腦損傷的保護作用[37]。白藜蘆醇可通過減輕氧化應(yīng)激、降低Fe2+保護心肌I/R損傷[38]。Liu等[39]報道葛根素能夠抑制脂質(zhì)過氧化和鐵過載,抗心肌細胞死亡。綜上可見,中藥活性成分可以調(diào)控Nrf2、GPX4表達及鐵代謝、脂質(zhì)過氧化,降低ROS產(chǎn)生和MDA水平,進而改善心腦血管疾病。

4.2.2 中藥復(fù)方抑制鐵死亡 越來越多的研究表明,中藥湯劑及注射液在心腦血管疾病動物/細胞模型中同樣發(fā)揮顯著的作用。研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液可降低心肌Fe2+和MDA含量,上調(diào)Nrf2和GPX4蛋白表達,減少心肌梗死面積[40]。用腦泰方治療大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠發(fā)現(xiàn),其可通過SCL7A11/GPX4途徑抑制神經(jīng)元鐵死亡[41]。何信用等[42]發(fā)現(xiàn)二陳湯合桃紅四物湯能明顯改善小鼠模型的動脈粥樣硬化,其機制是通過調(diào)控p53/SLC7A11介導(dǎo)的氧化損傷、降低鐵蛋白含量抑制鐵死亡。實驗證實,復(fù)方通絡(luò)湯可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鐵蛋白生成,抑制腦梗死疾病中的鐵死亡[43]。大量實驗發(fā)現(xiàn),中藥復(fù)方通過上調(diào)Nrf2、GPX4表達,降低Fe2+、鐵蛋白、MDA、P53水平,進而改善心腦血管疾病癥狀。復(fù)方中藥具有多種中藥生物活性成分,體現(xiàn)出其多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制鐵死亡的作用特點。心腦血管疾病辨證為血瘀證時,無論急性期或恢復(fù)期,均可采用活血化瘀法[44]。歸納發(fā)現(xiàn)上述中藥多為活血藥,如丹參、紅花、川芎、桃紅四物湯等。進一步加深對活血類中藥調(diào)節(jié)鐵死亡的相關(guān)研究,有助于完善此類中藥治療心腦血管疾病的藥效及其分子機制。

4.3 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)鐵死亡防治呼吸系統(tǒng)疾病

目前關(guān)于鐵死亡如何參與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的研究較少,中醫(yī)藥的相關(guān)研究更為鮮見。Lu等[45]在ALI小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn),牡荊素可以通過激活Nrf2/HO-1通路,降低ROS保護細胞免受脂質(zhì)過氧化來抑制ALI中的鐵死亡。人參環(huán)氧炔醇可以上調(diào)Keap1-Nrf2/HO-1通路從而減輕ALI的鐵死亡[46]。姜黃素可以通過降低MDA、SOD水平抑制脂質(zhì)過氧化,緩解大鼠骨骼肌I/R所致肺損傷[47]。

肺主氣,司呼吸,主行水;脾為氣血生化之源,主運化水液,因此肺和脾的關(guān)系就是氣和水的關(guān)系。肺脾功能受損可致各臟腑功能不協(xié)調(diào),防御能力不足,邪氣頻犯而導(dǎo)致慢性肺部疾病[48]。脾虛則水液運化失常,出現(xiàn)痰飲、濕濁、水腫等病理產(chǎn)物,影響肺的肅降,則出現(xiàn)咳、痰、喘。肺臟虛損,肺氣不利,氣滯血瘀,瘀久化熱,醞生毒邪,痰濕瘀毒互結(jié),嚴重者會出現(xiàn)肺間質(zhì)瘀血、滲出,甚至呼吸衰竭,相當于西醫(yī)中ALI、ARDS等重癥。前文論證了鐵死亡與脾的關(guān)系,肺與脾在病理生理上相互影響,因此鐵死亡在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮的作用及機制值得進一步探索,期望篩選出可特異性抑制鐵死亡的中藥防治呼吸系統(tǒng)疾病。中藥抑制鐵死亡防治缺血缺氧性疾病的相關(guān)機制見表1。

表1 中藥抑制鐵死亡防治缺血缺氧性疾病的相關(guān)機制

目前中醫(yī)藥抑制鐵死亡防治缺血缺氧性疾病的研究多側(cè)重于動物水平。大多數(shù)研究者采用“疾病-方藥-指標”的傳統(tǒng)藥理學實驗方法,疾病模型主要有心臟缺血再灌注、動脈粥樣硬化、腦卒中、急性肺損傷等,中藥主要通過干預(yù)脂質(zhì)過氧化、鐵代謝等通路發(fā)揮作用。然而對鐵死亡動物模型及細胞的研究匱乏,較少涉及心、腦、肺以外的器官,后續(xù)可以進一步加深中藥調(diào)節(jié)鐵死亡的機制研究。

5 結(jié)語

基于“氣血理論”及中醫(yī)脾與線粒體的關(guān)系,從脾虛探討鐵死亡的可能機制,有助于為進一步探討鐵死亡參與缺血缺氧性疾病的發(fā)生發(fā)展機制奠定中醫(yī)理論基礎(chǔ)。雖然近年有研究顯示,脂質(zhì)過氧化、ROS等參與鐵死亡的形成過程,但鐵死亡分子機制研究還很局限,因此中藥鐵死亡抑制劑的研發(fā)受到嚴重阻礙。下一步研究考慮可建立缺血缺氧性疾病動物模型,綜合應(yīng)用蛋白組學、基因工程干預(yù)等現(xiàn)代分子生物學技術(shù),開展疾病模型的組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能代謝等多方面的綜合評價,有助于深入探討鐵死亡的分子機制。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合分子對接、計算機模擬篩選等現(xiàn)代藥物研究技術(shù),應(yīng)用健脾益氣、補血活血類中藥及其有效成分開展干預(yù)研究,進行藥效評價分析其對鐵死亡的作用,可為研發(fā)提高缺血缺氧性疾病防治療效的天然藥物提供實驗依據(jù)。