舒剛欽，王 慧，張 琛，張?jiān)迫A，張 玲，程建波，范彩云，陳麗娟

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 安徽 合肥 230036）

構(gòu)樹(shù)(Broussonetia papyrifera)屬于?？浦参?，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的非常規(guī)林業(yè)蛋白飼料資源[1]。構(gòu)樹(shù)葉中粗蛋白含量豐富，最高可達(dá)干物質(zhì)含量的20%～30%，富含多種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸最為豐富，同時(shí)維生素、碳水化合物及微量元素等也頗為豐富。雖然構(gòu)樹(shù)枝葉作為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的畜禽飼料，但是構(gòu)樹(shù)葉直接作為飼料時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時(shí)構(gòu)樹(shù)葉中的抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧會(huì)使蛋白質(zhì)變性使得其難以被動(dòng)物消化吸收，導(dǎo)致了高達(dá)80%以上營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)從糞便中排出，利用效率不高[2-5]。研究表明青貯可以改善構(gòu)樹(shù)葉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高動(dòng)物利用率[6-7]。付錦濤等[8]研究表明在全株構(gòu)樹(shù)中添加乳酸菌和糖蜜可改善發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。黃媛等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在添加糖蜜的基礎(chǔ)上單獨(dú)或混合添加乳酸菌與纖維素酶能改善構(gòu)樹(shù)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。劉曉婧等[10]研究表明，在雜交構(gòu)樹(shù)中添加乳酸菌可降低青貯pH，提高青貯品質(zhì)。趙娜等[11]研究表明在構(gòu)樹(shù)葉青貯中增加乳酸菌含量可以提高青貯品質(zhì)，但不同來(lái)源的乳酸菌青貯效果存在差異。

青貯是依靠乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低青貯飼料的pH，抑制腐敗微生物和致病菌，達(dá)到長(zhǎng)期保存植物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高植物飼料適口性和消化率的目的[12]。目前，植物青貯飼料中的乳酸菌主要有兩個(gè)來(lái)源，一種是植物自身附著乳酸菌，另一種是人為添加的外源乳酸菌[13]。對(duì)于植物附著乳酸菌，一般都能適應(yīng)其原青貯原料，但由于大部分青貯原料表面附著乳酸菌數(shù)量小于105，難以滿足青貯發(fā)酵的要求，通常需添加外源乳酸菌以期迅速降低青貯原料的pH。但不同的青貯原料含有不同的微生物抑制因子，引起乳酸菌對(duì)青貯效果存在差異，導(dǎo)致青貯前期乳酸菌不能迅速擴(kuò)增，青貯環(huán)境中pH 不能迅速降低而致使青貯品質(zhì)下降[14-15]。構(gòu)樹(shù)中含有大量單寧，研究表明構(gòu)樹(shù)單寧對(duì)乳酸菌存在抑制作用，且不同來(lái)源的乳酸菌對(duì)單寧的耐受性存在差異[16]，構(gòu)樹(shù)單寧是否影響青貯效果尚未明確。為此，本研究從自然構(gòu)樹(shù)青貯中分離乳酸菌，研究構(gòu)樹(shù)來(lái)源不同乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)葉青貯效果的影響，旨在為調(diào)制優(yōu)質(zhì)構(gòu)樹(shù)葉青貯飼料提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的新鮮構(gòu)樹(shù)葉取自于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大楊店試驗(yàn)基地，新鮮構(gòu)樹(shù)葉干物質(zhì)(dry matter,DM)含量為鮮重的30.15%，粗蛋白質(zhì)(crude protein,CP)含量為干重的21.87%，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)含量為干重的28.35%，酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量為干重的21.68%，可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量為干重的6.15%。本試驗(yàn)使用構(gòu)樹(shù)單寧由實(shí)驗(yàn)室從構(gòu)樹(shù)中提取并保存。MRS 肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物(MRS 培養(yǎng)基，HB0384-1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離

以自然青貯構(gòu)樹(shù)料作為菌株分離源，先從青貯罐中取10 g 構(gòu)樹(shù)葉，將其加入到裝有90 mL 無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶(250 mL)中，并加入適量玻璃珠，封口膜封口后置于4 ℃冰箱中靜置浸提24 h，搖勻后稀釋成不同濃度涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上并置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。從上述培養(yǎng)平板中挑選出單菌落劃線分離直至得到純化菌株，隨后對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)[17]，染色結(jié)果呈陽(yáng)性并且過(guò)氧化氫酶接觸試驗(yàn)呈陰性的菌株進(jìn)行擴(kuò)增并傳代。-80 ℃甘油管保存菌種。

1.2.2 乳酸菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察MRS 固體培養(yǎng)基上單菌落的形態(tài)、大小、顏色，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。分子鑒定：提取菌株的DNA、采用16S rDNA 通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTC-AG；1492R:GGTTA CCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增成功后進(jìn)行測(cè)序，在NCBI 上進(jìn)行BLAST 序列同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 無(wú)菌單寧溶液的配制

將構(gòu)樹(shù)單寧高溫滅菌，用無(wú)菌水配制成不同濃度無(wú)菌單寧溶液待用。

1.2.4 乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各乳酸菌菌液于4 ℃離心3 min，將沉淀菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，然后用無(wú)菌生理鹽水重懸，調(diào)整菌液濃度至OD600= 0.8，吸取上述菌液各2.5 mL 分別添加至單寧濃度為0.05、0.1和0.2 g L-1的50 mL 無(wú)菌構(gòu)樹(shù)單寧溶液當(dāng)中，在轉(zhuǎn)速 為150 r·min-1的 搖 床 中 作 用30 min 后 取10 μL菌液進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)處理組重復(fù)3 次。

1.2.5 構(gòu)樹(shù)葉青貯調(diào)制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各乳酸菌菌液于4 ℃離心3 min，將沉淀菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，然后用無(wú)菌生理鹽水重懸，調(diào)菌濃度為1.0 × 109cfu·mL-1，作為青貯接種菌液。

將新鮮構(gòu)樹(shù)葉切碎至2～3 cm，混合均勻后作為青貯原料，設(shè)置5 個(gè)處理組，分別為對(duì)照組(PM0)、清酒乳桿菌組(PMQ)、戊糖片球菌組(PMW)、糞腸球菌組(PMF)與類(lèi)魏斯氏桿菌組(PML)，其中對(duì)照組添加5 mL 生理鹽水，其他試驗(yàn)組分別添加5 mL 含對(duì)應(yīng)乳酸菌菌液?；旌暇鶆蚝髮悠费b入青貯發(fā)酵袋(30 cm × 40 cm)中，裝袋量每袋500 g，真空封口機(jī)密封并使用真空泵抽真空，每個(gè)處理組重復(fù)3 次，在常溫、避光條件下青貯60 d 后開(kāi)封。

1.2.6 構(gòu)樹(shù)葉化學(xué)成分和發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定

干物質(zhì)、粗蛋白、中性和酸性洗滌纖維參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[18]方法測(cè)定，可溶性碳水化合物采用苯酚-硫酸法測(cè)定[19]。準(zhǔn)確稱取20 g青貯樣品，加入180 mL 無(wú)菌水于4 ℃浸提12 h 后，取浸提液測(cè)定發(fā)酵品質(zhì)。pH 參考邵新慶等[20]方法，使用梅特勒FE28 型精密pH 計(jì)測(cè)定；氨態(tài)氮/總氮(NH3-N/TN)參考閆貴龍等[21]方法，采用苯酚-次氯酸鈉法利用分光光度計(jì)測(cè)定；有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)含量采用高效液相色譜法測(cè)定[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件整理，利用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 氏法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P＜ 0.05 表示差異顯著，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)樹(shù)青貯料中乳酸菌的分離及生理生化鑒定

構(gòu)樹(shù)青貯料中共分離出4 株乳酸菌，分別命名為R1、R2、R3、R4。細(xì)菌形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果表明(表1)，固體培養(yǎng)基上R1和R2菌落均呈乳黃色，圓形凸起，表面光滑濕潤(rùn)，R3和R4均呈乳白色，圓形，表面光滑濕潤(rùn)。革蘭氏染色均為陽(yáng)性，其中R1和R4為桿狀，R2和R3為球狀(圖1)。經(jīng)過(guò)氧化氫酶、甘油、明膠液化試驗(yàn)[23]上述菌株均為陰性。葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)表明R1、R2和R3為陰性，而R4為陽(yáng)性。通過(guò)糖發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述4 株菌均能利用麥芽糖、甘露醇、菊糖、蔗糖、乳糖、馬尿酸和葡萄糖，R4不能利用纖維二糖和水楊苷，R1、R2和R3不能利用山梨醇，R3和R4不能利用棉籽糖。

圖1 青貯構(gòu)樹(shù)分離菌株顯微形態(tài)Figure 1 Micromorphology of the lactic acid bacteria isolated from Broussonetia papyrifera silage

表1 構(gòu)樹(shù)青貯料中分離菌株形態(tài)及生理生化特性Table 1 Morphological, physiological, and biochemical identification of the strains from Broussonetia papyrifera silage

2.2 構(gòu)樹(shù)青貯料分離乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

將16S rDNA 序列結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列數(shù)進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，R1與清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)基因序列同源性為100%，R2與戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)基因序列同源性為100%，R3與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)基因序列同源性為100% ，R4與類(lèi)腸膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)基因序列同源性為99.17% (圖2)。結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果確定構(gòu)樹(shù)枝葉中分離出4 株菌均為乳酸菌，其中R1為清酒乳桿菌，R2為戊糖片球菌，R3為糞腸球菌，R4為類(lèi)腸膜魏斯氏菌。

圖2 青貯構(gòu)樹(shù)分離乳酸菌進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of the lactic acid bacteria isolated from Broussonetia papyrifera silage

2.3 構(gòu)樹(shù)青貯料中分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性

構(gòu)樹(shù)青貯料中分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性結(jié)果表明(表2)，R2在同一濃度構(gòu)樹(shù)單寧作用下的存活率顯著高于其他菌株(P＜ 0.05)，R3顯著高于R1和R4(P＜ 0.05)，R4存活率最低；隨著單寧濃度的增加，乳酸菌的存活率均顯著降低(P＜ 0.05)。

表2 乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性Table 2 Tolerance of lactic acid bacteria to the Broussonetia papyrifera tannins cfu·mL-1

2.4 構(gòu)樹(shù)青貯料中分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)青貯營(yíng)養(yǎng)水平的影響

構(gòu)樹(shù)青貯料分離乳酸菌青貯構(gòu)樹(shù)葉對(duì)其營(yíng)養(yǎng)水平的影響結(jié)果表明(表3)，對(duì)照組DM 含量顯著低于各試驗(yàn)組(P＜ 0.05)，各試驗(yàn)組間差異不顯著(P＞ 0.05)，但PMW 和PMF 組 均高于PMQ 和PML組；試驗(yàn)組的CP 含量均顯著高于對(duì)照組(P＜ 0.05)，PMW 和PMF 組顯著高于PML 組(P＜ 0.05)；PMQ、PMW 和PMF 組的NDF 含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞ 0.05)；對(duì)照組ADF 顯 著 高 于PMW 和PMF 組(P＜ 0.05)，試 驗(yàn)組ADF 差異不顯著(P＞ 0.05)；各試驗(yàn)組WSC 含量差異不顯著(P＞ 0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P＜ 0.05)。

表3 青貯構(gòu)樹(shù)分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)葉青貯營(yíng)養(yǎng)水平的影響Table 3 Effects of lactic acid bacteria on the nutrient levels of Broussonetia papyrifera leaves silage

2.5 青貯構(gòu)樹(shù)分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯構(gòu)樹(shù)分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)葉青貯發(fā)酵品質(zhì)影響結(jié)果表明(表4)，添加乳酸菌試驗(yàn)組的pH 均顯著低于對(duì)照組(P＜ 0.05)，其中PMW 和PMF 組差異不顯著(P＞ 0.05)，PMQ 和PML 組差異不顯著(P＞0.05)；所有試驗(yàn)組乳酸含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)組PMQ、PMW 和PMF 組的乳酸含量均顯著高于PML 組(P＜ 0.05)；PML 組乙酸含量顯著高于其他試驗(yàn)組(P＜ 0.05)；對(duì)照組的丙酸含量顯著高于試驗(yàn)組(P＜ 0.05)，PML 組丙酸含量顯著高于其他試驗(yàn)組(P＜ 0.05)；對(duì)照組和PMW 組檢測(cè)到少量丁酸，其他各組均未檢測(cè)出丁酸；對(duì)照組和PML 組氨態(tài)氮含量顯著高于其他組(P＜ 0.05)，PMW 和PMF 組氨態(tài)氮含量顯著低于其他試驗(yàn)組(P＜ 0.05)。

3 討論

3.1 青貯構(gòu)樹(shù)乳酸菌的分離與鑒定

乳酸菌在青貯發(fā)酵過(guò)程中起著重要的作用，其種類(lèi)和數(shù)量對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)影響較大。制備青貯飼料的過(guò)程中必須具備數(shù)量多、活力強(qiáng)的乳酸菌，才能迅速降低pH，從而有效提高飼料青貯品質(zhì)[24]。自然條件下，植物表面附著各種微生物，除了乳酸菌外，還包括厭氧的梭狀芽孢桿菌屬、兼性厭氧的泛菌屬[25]、需氧的芽孢桿菌屬、藍(lán)細(xì)菌和大腸菌群[26-27]。好氧性細(xì)菌和大腸桿菌的數(shù)量多，而有益的乳酸菌含量較低。因而需通過(guò)添加外源乳酸菌加快發(fā)酵進(jìn)程，迅速產(chǎn)生大量乳酸，使pH 下降，抑制有害微生物的活動(dòng)，保存和提高青貯原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

已有研究表明不同青貯飼料中分離乳酸菌存在差異，郭剛等[28]從玉米(Zea may)秸稈青貯飼料中分離出糞腸球菌、植物乳桿菌和蒙氏腸球菌；李世丹等[29]從黑麥(Secale cereale)青貯飼料中分離得到植物乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和屎腸球菌；劉晗璐[30]從禾本科牧草披堿草(Elymus dahuricus)和老芒麥(E.sibiricus)表面分離篩選出植物乳桿菌和蒙氏腸球菌；張敏[31]從西藏青貯飼料中分離出戊糖片球菌和乳酸片球菌。本研究從構(gòu)樹(shù)青貯飼料中共分離出清酒乳桿菌、戊糖片球菌、糞腸球菌、類(lèi)腸膜魏斯氏菌4 種菌，與上述研究的植物中分離的乳酸菌存在一定差異，表明不同植物表面或青貯飼料中所分離出的乳酸菌種類(lèi)差異較大。這種植物分離乳酸菌的差異與自然環(huán)境、植物種類(lèi)、植物生育期、植物化學(xué)成分等有很大相關(guān)性[32-35]。

3.2 構(gòu)樹(shù)青貯料中分離乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性差異的影響

單寧對(duì)微生物的抑制作用主要是因?yàn)閱螌幠芘c主要蛋白質(zhì)如酶等形成氫鍵作用[36]，植物單寧分為水解單寧和縮合單寧，其中水解單寧的分子量小于其縮合單寧[37]，而單寧分子量大小決定其對(duì)微生物毒性的大小，一般小分子量單寧與蛋白質(zhì)形成氫鍵，嵌入到微生物的活性部位，抑制微生物[38]，但單寧聚合體與水解單寧相比，其對(duì)微生物的毒性反而降低[39]。上述理論預(yù)示同一單寧對(duì)不同微生物的抑制作用差異性可能不大，但本研究結(jié)果顯示構(gòu)樹(shù)來(lái)源的不同乳酸菌對(duì)同一種構(gòu)樹(shù)單寧的耐受性差異較大，其中戊糖片球菌對(duì)單寧的耐受性能最強(qiáng)，這種差異可能與某些乳酸菌可以分泌特定單寧酶對(duì)目標(biāo)單寧結(jié)進(jìn)行降解，從而減少單寧對(duì)該乳酸菌的抑制作用[40]，至于本研究中所獲得的乳酸菌是否分泌單寧酶需要進(jìn)一步驗(yàn)證。當(dāng)單寧有一定關(guān)系同時(shí)隨著構(gòu)樹(shù)單寧濃度的逐漸升高，乳酸菌對(duì)單寧的耐受性呈線性下降趨勢(shì)。該結(jié)果表明不同微生物對(duì)由于其微生物蛋白的組成差異導(dǎo)致微生物對(duì)單寧的耐受性存在差異，從而影響微生物在生產(chǎn)中的活性，特別是青貯微生物浸入到含單寧的青貯原料中時(shí)，從而影響青貯效果。

3.3 青貯構(gòu)樹(shù)乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

青貯料干物質(zhì)含量是評(píng)定青貯飼料品質(zhì)的重要因素，青貯料干物質(zhì)的減少意味著原料青貯后營(yíng)養(yǎng)成分的損失[41]。本研究中，對(duì)照組DM 含量顯著低于試驗(yàn)組，表明試驗(yàn)組中構(gòu)樹(shù)源乳酸菌的添加有利于構(gòu)樹(shù)青貯DM 保存，減少其損失。CP 是飼料中重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料青貯過(guò)程中添加乳酸菌制劑有利于青貯料CP 保存[42-44]。在本研究中，添加乳酸菌的試驗(yàn)組CP 含量均高于對(duì)照組，主要是由于構(gòu)樹(shù)青貯發(fā)酵外源乳酸菌的添加，快速降低構(gòu)樹(shù)青貯發(fā)酵環(huán)境的pH，有利于抑制有害微生物的繁殖和對(duì)青貯料CP 的分解，從而減少其的損失[45-46]。同樣是乳酸菌，添加糞腸球菌和戊糖片球菌組的CP 含量顯著高于PMQ 和PML 組，這可能與糞腸球菌和戊糖片球菌對(duì)構(gòu)樹(shù)中單寧耐受性或其他化學(xué)成分的適應(yīng)性有一定相關(guān)性，特別是青貯早期非構(gòu)樹(shù)來(lái)源植物乳酸菌繁殖速度難以適應(yīng)青貯環(huán)境，導(dǎo)致CP 的損失。青貯前后NDF 的含量受青貯微生物的影響，已有研究表明參與NDF 降解的微生物主要是真核微生物，而細(xì)菌一般不參與NDF 的降解[47]。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組NDF 顯著低于PMQ、PMW 和PMF組，表明青貯過(guò)程中有真核微生物參與了構(gòu)樹(shù)葉NDF 的降解。同時(shí)由于對(duì)照組的WSC 被有害微生物大量消耗，對(duì)照組中的微生物需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如木霉屬和曲霉屬等能產(chǎn)生阿魏酸酯酶，促進(jìn)半纖維素和木質(zhì)素等水解，從而利用了NDF 中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，進(jìn)而導(dǎo)致NDF 降低[48]，而試驗(yàn)組由于有外源乳酸菌的介入，加快青貯環(huán)境的pH 降低，減少NDF 降解。WSC 作為青貯發(fā)酵的底物，會(huì)被乳酸菌分解產(chǎn)生乳酸，從而使青貯飼料的pH 降低[49]。試驗(yàn)組的WSC 含量顯著高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)樵谇噘A前期對(duì)照組的好氧微生物大量繁殖，消耗了大量的WSC，而試驗(yàn)組由于乳酸菌的添加導(dǎo)致有害微生物的減少，從而減少了WSC 的損失。

3.4 青貯構(gòu)樹(shù)乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH 和乳酸含量是衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。由于低pH 可以抑制有害微生物，所以一般青貯飼料的品質(zhì)越好，其pH 越低[50-51]。本研究結(jié)果表明，各試驗(yàn)組pH 均顯著低于對(duì)照組，表明構(gòu)樹(shù)源乳酸菌的添加有利于構(gòu)樹(shù)葉青貯環(huán)境pH 降低，其中添加戊糖片球菌和糞腸球菌的PMW 和PMF組pH 顯著低于PMQ 和PML 組，這種現(xiàn)象表明前兩種乳酸菌更能適應(yīng)構(gòu)樹(shù)青貯環(huán)境，有利于其青貯初期迅速增殖。本研究中，所測(cè)的各處理組青貯后的pH 均在4.3 以上，高于常規(guī)牧草青貯時(shí)獲得的優(yōu)質(zhì)品質(zhì)的pH 4.2，這是由于構(gòu)樹(shù)葉WSC 含量低，蛋白含量高，緩沖能值較高，限制構(gòu)樹(shù)葉的發(fā)酵，不利于pH 降低[52-54]，但結(jié)合不同乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧的耐受性結(jié)果表明，構(gòu)樹(shù)單寧對(duì)乳酸菌的影響與構(gòu)樹(shù)青貯pH 降低效果存在相關(guān)性。乳酸菌在青貯中通過(guò)產(chǎn)生大量有機(jī)酸來(lái)降低青貯環(huán)境pH，有機(jī)酸主要包括乳酸、乙酸、丙酸等。本研究發(fā)現(xiàn)添加構(gòu)樹(shù)來(lái)源的類(lèi)腸膜魏斯氏菌的PML 組和對(duì)照組乳酸含量顯著低于其他試驗(yàn)組，這可能與類(lèi)魏斯氏桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，在青貯中會(huì)將乳酸菌分解產(chǎn)生乙酸有關(guān)[55]，PML 中的乙酸含量顯著高于其他組也證明了這個(gè)結(jié)果。各試驗(yàn)組丙酸含量均顯著低于對(duì)照組，表明試驗(yàn)組外源乳酸菌降低了發(fā)酵環(huán)境的pH，抑制了有害微生物的增殖[56]。丁酸是由腐敗菌分解蛋白質(zhì)、乳酸所產(chǎn)生的，丁酸含量越低，飼料的發(fā)酵品質(zhì)越好[57]。本研究中對(duì)照組和PMW 組檢測(cè)出少量丁酸，表明富集后的構(gòu)樹(shù)源乳酸菌添加可降低構(gòu)樹(shù)青貯料受有害微生物污染的機(jī)率。氨態(tài)氮是反映青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)降解程度的指標(biāo)，其含量越高表明青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)降解越多，發(fā)酵品質(zhì)越差[58]。本研究中，PMF 和PMW 組的氨態(tài)氮含量顯著低于對(duì)照組，表明構(gòu)樹(shù)來(lái)源糞腸球菌和戊糖片球菌有利于構(gòu)樹(shù)青貯，避免青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)被梭菌等有害微生物過(guò)多降解[59]。

4 結(jié)論

本研究從青貯構(gòu)樹(shù)中共分離出4 種乳酸菌，其中R1為清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)，R2為戊糖片 球 菌(Pediococcus pentosaceus)，R3為 糞 腸 球菌(Enterococcus faecalis)，R4為 類(lèi) 腸 膜 魏 斯 氏菌(Weissella paramesenteroides)，這4 種構(gòu)樹(shù)來(lái)源乳酸菌分別青貯構(gòu)樹(shù)葉均有利于構(gòu)樹(shù)葉青貯品質(zhì)提高，但構(gòu)樹(shù)源不同乳酸菌對(duì)構(gòu)樹(shù)單寧耐受性不同，同時(shí)對(duì)構(gòu)樹(shù)葉青貯品質(zhì)影響存在差異，本研究中戊糖片球菌和糞腸球菌更有利于構(gòu)樹(shù)青貯品質(zhì)提高。