吳 君，陸嬌嬌，鄭珊珊，王思琦，施碧紅，2*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350117; 2.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物與發(fā)酵技術(shù)國(guó)家聯(lián)合工程研究中心, 福建 福州 350117)

絲狀真菌種類(lèi)繁多，包括曲霉、木霉、毛霉和青霉等，它們與人類(lèi)活動(dòng)息息相關(guān)，一些被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵食品、工業(yè)酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物，如青霉素、灰黃霉素生產(chǎn)者產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum[1]、灰黃青霉Penicilliumgriseofulvum[2]；各種酶制劑、有機(jī)酸等的生產(chǎn)菌米曲霉Aspergillusoryzae[3]、黑曲霉Aspergillusniger[4]等。同時(shí)還有不少種類(lèi)是重要的植物病原菌，少數(shù)可侵染動(dòng)物或人類(lèi)，引起真菌感染。由于絲狀真菌基因組中含有大量與生物降解、初級(jí)和次級(jí)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因，且具有強(qiáng)大的合成和分泌大量蛋白質(zhì)的能力，因此是生產(chǎn)異源蛋白的理想宿主[5]。

曲霉屬和青霉屬是已報(bào)道的產(chǎn)生外代謝產(chǎn)物最豐富的兩類(lèi)絲狀真菌，曲霉屬的每個(gè)物種平均產(chǎn)生外代謝物5.77種，青霉為3.77種，且該數(shù)據(jù)仍有可能被低估[6]。因此曲霉和青霉中的一些物種是作為細(xì)胞工廠或工業(yè)微生物育種的重要材料。曲霉和青霉菌的營(yíng)養(yǎng)體具有發(fā)達(dá)的菌絲，有隔膜和分枝。其生活史以無(wú)性繁殖為主，產(chǎn)生具有獨(dú)特形態(tài)結(jié)構(gòu)的分生孢子梗和大量的無(wú)性孢子-分生孢子。其有性孢子為子囊孢子，但在曲霉和青霉這兩個(gè)重要的屬中，有些種很少產(chǎn)生或從不產(chǎn)生子囊果，而以分生孢子進(jìn)行繁殖。然而分生孢子核型具有多樣性，少數(shù)為單核、多數(shù)為多核孢子。盡管真菌多核性的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)是眾所周知的，多核的分生孢子不僅具有較高的發(fā)芽效率外，還有較強(qiáng)的生存能力和對(duì)紫外線(xiàn)輻射、凍融處理的抗性[7]，因此可以有效提高絲狀真菌在壓力環(huán)境條件下的生存效率。多核特性對(duì)真菌進(jìn)化亦至關(guān)重要，通過(guò)異核體導(dǎo)致不同遺傳性的核融合而產(chǎn)生新的基因型，使得真菌種群不斷進(jìn)化得以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境。但是，多核特性亦會(huì)削弱遺傳操作產(chǎn)生的表型效應(yīng)，如異核轉(zhuǎn)化子導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平的下降等。開(kāi)展真菌分生孢子核型研究對(duì)解析絲狀真菌細(xì)胞生理生化、遺傳變異機(jī)制以及對(duì)真菌遺傳育種和病原真菌防治都具有重要意義，因此本文就曲霉等絲狀真菌分生孢子的發(fā)育及其核型變化調(diào)控相關(guān)基因的功能進(jìn)行歸納，為更好地開(kāi)展相關(guān)物種的遺傳操作提供理論基礎(chǔ)。

1 絲狀真菌分生孢子發(fā)育過(guò)程的基因調(diào)控

分生孢子是絕大多數(shù)曲霉、青霉屬絲狀真菌的無(wú)性生殖細(xì)胞。分生孢子產(chǎn)生于由菌絲分化而形成的分生孢子梗上，分生孢子梗始于菌絲的厚壁足細(xì)胞生出并向空中伸長(zhǎng)，產(chǎn)生氣生莖。莖停止延伸后開(kāi)始膨脹，形成囊泡，在囊泡膨脹階段，囊泡內(nèi)進(jìn)行大量核分裂復(fù)制，接著出芽產(chǎn)生瓶梗，囊泡內(nèi)細(xì)胞核遷移到瓶梗，瓶梗繼續(xù)進(jìn)行出芽生殖，通過(guò)重復(fù)不對(duì)稱(chēng)分裂產(chǎn)生分生孢子鏈，并且在出芽點(diǎn)與孢子連接處形成隔膜[8]。當(dāng)囊泡膨脹和分生孢子伸長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞核會(huì)同時(shí)經(jīng)歷幾次有絲分裂，并逐步從菌絲體遷移到孢子中。總之，在分生孢子形成過(guò)程中，菌絲中的細(xì)胞核經(jīng)過(guò)一系列核分裂、核遷移到形成隔膜，最后形成菌絲分支。分生孢子的形成過(guò)程受到多種基因調(diào)控(表1)。

表1 常見(jiàn)的控制分生孢子形成的基因

表2 常見(jiàn)的控制核分裂及核遷移的基因

分生孢子發(fā)育通常受brlA、abaA、wetA、stuA和medA等基因的協(xié)同調(diào)控[6，18]，它們的表達(dá)產(chǎn)物直接促進(jìn)分生孢子梗的形成(表1)。分生孢子發(fā)育的關(guān)鍵步驟是激活編碼C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基因brlA，該基因還誘導(dǎo)無(wú)性發(fā)育所需的其他基因abaA和wetA的表達(dá)。abaA是分生孢子瓶梗正常形成所必需的，abaA突變體導(dǎo)致珠狀孢子的生成，abaA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)終止和細(xì)胞空泡化。wetA是分生孢子特異性基因的(轉(zhuǎn)錄)調(diào)控因子，由brlA和abaA順序表達(dá)激活，wetA突變體無(wú)法積累分生孢子特異性基因的mRNA。brlA、abaA和wetA這三個(gè)基因被定義為一個(gè)中央調(diào)控通路，通過(guò)brlA、abaA和wetA基因的順次激活決定分生孢子形成和成熟的特異性基因表達(dá)[9]。stuA和medA是調(diào)控分生孢子有序分化和空間組織所必需的，這兩個(gè)基因中的任一突變都會(huì)導(dǎo)致空間紊亂的分生孢子梗。

2 絲狀真菌分生孢子核型變化過(guò)程的基因調(diào)控

絲狀真菌具有多種生殖方式，一些絲狀真菌在其生活史中不發(fā)生有性生殖過(guò)程，其細(xì)胞核在有絲分裂過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷準(zhǔn)性重組事件，造成異核體、同核體、重組單倍體或二倍體的存在，故其菌絲和分生孢子中可以保持單核或多核狀態(tài)。大多數(shù)絲狀真菌的分生孢子具有核異質(zhì)性，如Aspergillusflavus、Aspergillusoryzae、Neurosporacrass、Peniclliumchrysogenum及Microsporumgypseum等，且在其整個(gè)生命周期中具有單核、多核或兩者共存狀態(tài)[19]。多核特性使絲狀真菌適應(yīng)更廣泛環(huán)境，但同時(shí)也增加了對(duì)其進(jìn)行遺傳分析及菌種改良的難度，如隱性突變體的獲得等。真菌細(xì)胞核動(dòng)力學(xué)是多核形成的重要基礎(chǔ)，也是維持分生孢子正常發(fā)育的關(guān)鍵，涉及微管、肌動(dòng)蛋白、動(dòng)力蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白和調(diào)節(jié)因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。有關(guān)分生孢子核型變化過(guò)程基因調(diào)控的機(jī)制研究在不斷進(jìn)行中。

2.1 核分裂過(guò)程的基因調(diào)控

絲狀真菌分生孢子形態(tài)與生長(zhǎng)和核分裂密切相關(guān)。分生孢子發(fā)育與細(xì)胞有絲分裂周期相偶聯(lián)，在絲狀真菌形成的分生孢子中還含有一些停滯在有絲分裂G1期的單核孢子，這些孢子經(jīng)歷新一輪萌發(fā)，頂端開(kāi)始極化生長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞核再次進(jìn)入有絲分裂周期。核分裂在A.nidulans由兩種不同的蛋白激酶的活性控制，分別是nimXcdc2編碼的周期蛋白依賴(lài)性激酶p34nimX和nimA編碼的NIMA蛋白激酶。p34nimX的激活需要與細(xì)胞周期蛋白NIMEcyclinB相結(jié)合，其活性在核分裂時(shí)顯著提高[20]。NIMA促進(jìn)有絲分裂，同時(shí)抑制孢子極性生長(zhǎng)，但是在最佳生長(zhǎng)條件時(shí)孢子進(jìn)行極化生長(zhǎng)的前提是核完成第一輪有絲分裂[21]。Morris[22]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期缺陷突變體在43.5℃限制性溫度下，其細(xì)胞核雖然不能完成第一次有絲分裂，但孢子依舊能進(jìn)行極化生長(zhǎng)。因此，蛋白激酶和環(huán)境生長(zhǎng)信號(hào)共同組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)孢子極化形態(tài)發(fā)生與核分裂周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

絲狀真菌通過(guò)形成隔膜完成胞質(zhì)分裂，其中心孔是細(xì)胞核等細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)的通道[23]。隔膜的形成也依賴(lài)于核分裂，且需要將肌動(dòng)蛋白聚集到隔膜形成的部位。在一個(gè)腔室中所有核開(kāi)始有絲分裂后約10分鐘會(huì)出現(xiàn)隔膜，隨著菌絲的生長(zhǎng)，繼續(xù)形成新的隔膜和菌絲細(xì)胞[24]。在A.nidulans野生株中，胞質(zhì)分離發(fā)生在核分裂三輪之后，該過(guò)程由Sep家族基因參與協(xié)調(diào)[25]。sep突變體有兩種類(lèi)型，其中sepB、sepE、sepI或sepJ突變株能夠在37℃限制溫度下完成三到四輪核分裂，但由于無(wú)法形成隔膜所以停止生長(zhǎng)。sepA、sepD、sepG和sepH突變株在限制溫度下形成隔膜原基，但在隔膜組裝后期被阻斷。

2.2 核遷移過(guò)程的基因調(diào)控

絲狀真菌多核分生孢子的形成與核遷移有關(guān)。核遷移通常發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，多核的產(chǎn)生不是由新形成的分生孢子繼續(xù)有絲分裂形成的，而是通過(guò)細(xì)胞核向子代遷移形成[26]。核遷移方式的多樣性導(dǎo)致核型的多樣，這主要與微管組織中心(MTOC)驅(qū)動(dòng)的微管(MT)蛋白系統(tǒng)相關(guān)，包括細(xì)胞質(zhì)微管(CMT)、紡錘體微管(SPB)和星狀微管，細(xì)胞核的位置取決于MT的位置。微管在有絲分裂時(shí)在細(xì)胞核內(nèi)形成紡錘體，在間期形成胞質(zhì)軌道[27]，可直接對(duì)細(xì)胞核施加拉力和推力或通過(guò)與MTOC的連接參與核定位。在多核絲狀真菌中，CMT細(xì)胞骨架具有控制同一細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞核遷移和分布的能力。此外，核遷移還可以依賴(lài)其他細(xì)胞器沿MT運(yùn)動(dòng)，這些細(xì)胞器不是從頭合成的，而是在細(xì)胞分裂時(shí)傳給子細(xì)胞，必須在胞質(zhì)分離前被精確定位。在S.cerevisiae中，核定位通過(guò)源自紡錘體的細(xì)胞質(zhì)微管進(jìn)行。由于紡錘體在核膜內(nèi)組裝，細(xì)胞核在有絲分裂前必須精確地定位在母芽頸部，以便為母細(xì)胞和芽提供遺傳物質(zhì)，然后核內(nèi)SPB的伸長(zhǎng)使得核從母細(xì)胞移動(dòng)到子細(xì)胞[28-29]。肌動(dòng)蛋白在核遷移過(guò)程中與微管協(xié)同作用，主要通過(guò)兩種機(jī)制在核定位中起作用：肌動(dòng)球蛋白收縮，或肌動(dòng)蛋白偶聯(lián)跨膜肌動(dòng)蛋白逆行流動(dòng)。胞質(zhì)動(dòng)力蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白是MT的主要馬達(dá)，可以直接連接MT的核膜或控制MT張力，其功能需要?jiǎng)恿Φ鞍准せ畹鞍椎妮o助[30]。Maruyama，J[31]等克隆并鑒定了米曲霉細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白重鏈編碼基因(dhcA)，證實(shí)了胞質(zhì)動(dòng)力蛋白還在維持米曲霉分生孢子核數(shù)目方面起作用。除此之外，my01、act1、c1n、ypt1、spaI、tcp1、dyn1、jnm1、nup1等基因的功能也是調(diào)控細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)所必需的。這些基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)與微管相互作用，有些參與微管的穩(wěn)定[32]。由此可得，控制細(xì)胞核的位置普遍通過(guò)主動(dòng)遷移機(jī)制和細(xì)胞核正確錨定機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)，這對(duì)于真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要。

絲狀真菌的菌絲通過(guò)頂端極化生長(zhǎng)形成相互聯(lián)系的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，菌絲體中的多個(gè)細(xì)胞核會(huì)彼此保持適當(dāng)?shù)木嚯x，這需要胞質(zhì)動(dòng)力蛋白和動(dòng)力蛋白復(fù)合物以及其他幾種蛋白質(zhì)共同作用，涉及五個(gè)相關(guān)基因，分別是nudA、nudC、nudE、nudF和nudG[27]。nud突變體的細(xì)胞核在42℃限制溫度下不能從萌發(fā)孢子體移到分生孢子梗中，導(dǎo)致細(xì)胞核分布異常，多數(shù)聚集在菌絲隔膜附近[33]。nudA編碼細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白的重鏈，nudC參與核遷移和頂端極性生長(zhǎng)，但nudC突變不影響微管結(jié)構(gòu)的完整，也不參與核分裂，它與微管蛋白、肌動(dòng)蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白之一相互作用或是調(diào)節(jié)其活性[34]。A.nidulans的nudE編碼產(chǎn)物NUDE是N.crassa的核分布蛋白R(shí)O11的同源物，在細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白通路中起作用。nudF[35]基因編碼一個(gè)包含β-轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白重復(fù)序列的保守蛋白，因其與異源三聚體G蛋白亞基序列相似，表明該蛋白與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[26]。另外還在S.cerevisiae和哺乳動(dòng)物中分別發(fā)現(xiàn)了NUDE的同源物PAC1和LIS1參與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白功能，并且哺乳動(dòng)物的NUDC同源物也與LIS1蛋白相互作用[36]。這表明nud家族基因共同組成胞質(zhì)動(dòng)力蛋白調(diào)節(jié)通路，并且調(diào)節(jié)機(jī)制是保守的。

核遷移是菌絲頂端發(fā)生極化生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，由多種蛋白共同調(diào)控。其中一種核定位蛋白APS(包括APSA和APSB)定位于菌絲的細(xì)胞質(zhì)膜[37]，Suelmann[38]在A.nidulans構(gòu)建stu-GFP融合系統(tǒng)，利用熒光顯微鏡和延時(shí)成像追蹤細(xì)胞核遷移，觀察到多核菌絲細(xì)胞的一個(gè)腔室中，整體上所有核都向菌絲頂端遷移，但每個(gè)核的遷移速率不同。這表明存在控制同一細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各個(gè)核運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)與微管、馬達(dá)蛋白連接或觸發(fā)馬達(dá)蛋白活性來(lái)調(diào)控核運(yùn)動(dòng)，該調(diào)節(jié)因子即Aps。在Aps缺失株中，分生孢子在初生孢子梗形成之前發(fā)育正常。在形成初生孢子梗的過(guò)程中，細(xì)胞核無(wú)法從囊泡遷移到瓶梗，并且不能激活發(fā)育特異基因。但細(xì)胞核偶爾也會(huì)進(jìn)入初生孢子梗，這些孢子梗就會(huì)繼續(xù)形成產(chǎn)孢瓶梗細(xì)胞，從而完成生命周期。這表明細(xì)胞核進(jìn)入初生孢子梗是一個(gè)發(fā)育節(jié)點(diǎn)，確保菌絲的形成。發(fā)育缺陷型Aps突變體細(xì)胞核未能進(jìn)入初生孢子梗，發(fā)育停止在瓶梗起始階段。除發(fā)育停滯外，許多分生孢子特異性基因在ApsA突變體中沒(méi)有活性，這表明ApsA基因產(chǎn)物可能直接激活它們，或者ApsA是指導(dǎo)這些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了ApsA蛋白的同源物NUM1p，該蛋白在細(xì)胞周期的G2階段定位于酵母母細(xì)胞的皮層，并與星狀微管相互作用[39]。

在A.nidulans中除了產(chǎn)生單核分生孢子外，在相同的環(huán)境條件下還以恒定的比例產(chǎn)生雙核和三核分生孢子，該性狀由bncA單基因控制[40]。它在異核體中非自主表達(dá)且受溫度影響，參與細(xì)胞核從囊泡向初生孢子梗的遷移過(guò)程[41-42]?？梢?jiàn)bncA基因與Aps基因調(diào)控方式相反。在Aps突變體中，細(xì)胞核移動(dòng)到囊泡后不能繼續(xù)向初生孢子梗移動(dòng)，因此發(fā)育在瓶梗階段停滯。而在bncA基因存在下，兩個(gè)核可以向初生孢子梗移動(dòng)，這表明雙核分生孢子的產(chǎn)生可能是由于兩個(gè)核結(jié)合到初生孢子梗中形成的。在bncA突變體中細(xì)胞核進(jìn)入初生孢子梗就會(huì)形成隔膜，因此不會(huì)形成1個(gè)以上的核。本實(shí)驗(yàn)室也通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)在A.oryzae中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與分生孢子核型相關(guān)的候選基因，有關(guān)此兩基因的功能驗(yàn)證尚在進(jìn)行中。

3 展望

絲狀真菌種類(lèi)繁多、分布廣泛，在基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組等各種組學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)其功能基因的深入發(fā)掘，促進(jìn)我們了解無(wú)性孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)差異和繁殖方式等各種復(fù)雜行為形成的機(jī)理，為更好地利用絲狀真菌提供理論指導(dǎo)。絲狀真菌作為細(xì)胞工廠，廣泛用于生產(chǎn)各種抗生素、有機(jī)酸、酶和維生素等，新技術(shù)諸如CRISPR等在絲狀真菌基因組中的應(yīng)用可改善其多核特性帶來(lái)的不良效應(yīng)，加快絲狀真菌遺傳改良效率[47-48]，構(gòu)建高效遺傳操作體系，更好地為人類(lèi)服務(wù)。同時(shí)，CRISPR技術(shù)在絲狀真菌中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步完善，如其適用性、可擴(kuò)展性和靶向效率方面仍有待改進(jìn)。

在利用絲狀真菌為人類(lèi)創(chuàng)造財(cái)富的同時(shí)，也不應(yīng)忽視一些絲狀真菌物種對(duì)動(dòng)植物的潛在威脅。如A.fumigatus，A.flavus和Talaromycesmarneffei等已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為重要的病原微生物[49-50]。了解分生孢子繁殖方式的機(jī)制有助于制定出有效的病害診斷措施和特異性抗真菌藥物。CRISPR-Cas9的應(yīng)用成功鑒別T.marneffei致病性的關(guān)鍵基因[51]，從遺傳水平闡明致病真菌的發(fā)病機(jī)制，并為分子抗真菌治療提供靶點(diǎn)。未來(lái)，在深入挖掘絲狀真菌各類(lèi)組學(xué)信息和充分利用分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，改善真菌疾病的檢測(cè)、預(yù)防和治療方法，并為開(kāi)發(fā)利用絲狀真菌資源發(fā)揮積極作用。