朱國(guó)青

(浙江大學(xué) 浙江大學(xué)電子顯微鏡中心 材料科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310027)

齲,朽也,齲齒也常被國(guó)人叫做蛀牙或蟲(chóng)牙,其英文名為Dental caries(caries來(lái)自拉丁語(yǔ)decay),即牙齒的腐爛(Decay in teeth),異曲同工。如何預(yù)防和治療齲齒,是人們生活水平提高后對(duì)健康甚至是精神層次的更高要求。已被廣為接受的齲變過(guò)程是,因牙齒排列不整齊,比如牙齒之間縫隙比較大或有裂溝,亦或有重疊,牙齒有凹坑等,這些部位常有食物殘?jiān)鼫?而且不易被日常的刷牙、漱口操作去除,易于形成牙菌斑堆積而緊貼牙釉質(zhì),食物殘留在唾液環(huán)境中被細(xì)菌分解產(chǎn)生酸,牙釉質(zhì)脫礦成齲,也就是酸源(化學(xué)寄生)學(xué)說(shuō)[1]。比如考古學(xué)家就發(fā)現(xiàn)古代非洲農(nóng)人主要食用不含糖的谷物粥和酸奶,而他們的牙齒磨耗很輕但齲齒較嚴(yán)重,認(rèn)為這可能是因?yàn)橹嗝尊じ皆谒麄兊难例X之間不能得到及時(shí)有效的清理,使之成為細(xì)菌滋生的溫床[2]。另外也有一些其他理論,如蛋白溶解理論和蛋白溶解-螯合理論。而牙結(jié)石是礦化了的牙菌斑和細(xì)胞碎片,其礦物質(zhì)來(lái)源于唾液中所含的鈣、磷等礦物鹽[3]。因齲變多是從牙齒表面(牙釉質(zhì),俗稱(chēng)琺瑯質(zhì))開(kāi)始被觀察到,所以作者試從健康牙釉質(zhì)、齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的成分進(jìn)行研究牙齒齲變過(guò)程。

能譜作為材料成分分析常用工具,原理是電子束和樣品作用,原子的電子發(fā)生躍遷,其能量差作為特征X射線放出,部分X光子經(jīng)能譜探頭窗口被接收,在硅漂移探測(cè)器(SDD)產(chǎn)生電子-空穴,由此產(chǎn)生的微小電荷脈沖由前置放大器處理和轉(zhuǎn)換后經(jīng)過(guò)多道分析器,最終得到一個(gè)以通道(能量)為橫坐標(biāo)、以通道計(jì)數(shù)(強(qiáng)度)為縱坐標(biāo)的X射線能量色散譜。本文所用儀器能譜采用了多道(可達(dá)4 096)脈沖分析器,可分析從能譜分辨率(本儀器為0.127 keV)到40 keV,故而可以同時(shí)分析多種元素,且分析速度快,定量和定性分析過(guò)程無(wú)需等待,比較適合于快速、定點(diǎn)分析。此外,它還有分析體積小,空間靈敏度高等特點(diǎn)。不過(guò)能譜分析時(shí),也要關(guān)注逃逸峰、和峰、內(nèi)部熒光峰和重疊峰等問(wèn)題。牙釉質(zhì)作為人體礦化程度最高的組織,主要成分是羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP,Ca10(PO4)6(OH)2),除H以外其他元素(Ca、P和O)都可以被能譜探測(cè)到,得到能譜譜圖之后只需要點(diǎn)擊幾下按鈕即可快速得到定量結(jié)果(指定元素的質(zhì)量百分比和原子百分比)。

SPSS(Statistical Productand Service Solutions,統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案),誕生于1968年,自2000年改為現(xiàn)有名字。半個(gè)世紀(jì)以來(lái),SPSS在社會(huì)科學(xué)和自然科學(xué)各個(gè)方面都得到了廣泛使用,操作簡(jiǎn)單、不易出錯(cuò)。SPSSAU是在線版SPSS軟件(始于2017年),使用起來(lái)更加簡(jiǎn)便、智能。從CNKI檢索平臺(tái)、維普期刊、Web of Science檢索平臺(tái)等理工科常用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索平臺(tái)都可以看出,SPSSAU的使用,在近兩年來(lái)有明顯提升,認(rèn)可度較高。

本研究作者利用球差矯正場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(FEI Titan G260-300,能譜型號(hào)為Oxford X-MaxN80T),取商品羥基磷灰石為參照物,以健康牙釉質(zhì)、齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石為試材,對(duì)其組成成分(特別是P/Ca原子數(shù)量比)進(jìn)行初步探究,后利用SPSSAU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并討論了牙釉質(zhì)的齲變機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)材料:完整的人體智齒一顆,窩處有黃褐色齲變,其他部分無(wú)明顯病變(健康牙釉質(zhì));牙結(jié)石一塊(牙齒上自然脫落、硬質(zhì)、黃褐色)。

(2)參照物:商品羥基磷灰石(Hydroxylapatite)、99%、針狀、CAS:1306-06-5,生產(chǎn)商:河北百靈威超精細(xì)材料有限公司。

(3)乙醇(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

球差矯正場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(FEI Titan G260-300),能譜配件型號(hào):Oxford X-MaxN80T,用儀器出廠標(biāo)配的TEM Imaging and Analysis(俗稱(chēng)TIA)進(jìn)行能譜采集和成分分析,后利用SPSSAU對(duì)所得成分比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

參照樣和試材諸樣本均瑪瑙研缽研磨并借助乙醇分散,后滴到透射電鏡專(zhuān)用網(wǎng)上,自然揮發(fā)干燥后進(jìn)行透射電鏡觀察。

圖1～6為透射電鏡EDS譜圖示例(含元素原子占比列表),表1是電鏡生成EDS譜圖之后,由電鏡的TIA軟件自動(dòng)計(jì)算再由SPSSAU統(tǒng)計(jì)的P/Ca原子數(shù)量比匯總表。需要說(shuō)明的是,因所用載網(wǎng)的能譜結(jié)果主要為C,含有少量O、Si、Cu(圖2),采集各實(shí)驗(yàn)材料和參照樣本的能譜譜圖并作計(jì)算時(shí)C、O、Si、Cu成分含量會(huì)略高于實(shí)際數(shù)值,而其他元素成分占比會(huì)略低,不過(guò)因?yàn)槭窃谕瑯拥膶?shí)驗(yàn)條件下測(cè)試,不同樣本之間具有可比性。

表1 能譜分析樣品的P/Ca原子數(shù)量比

圖1 商品羥基磷灰石的能譜譜圖和成分比例

圖2 TEM專(zhuān)用銅網(wǎng)上碳膜的能譜譜圖和成分比例

圖3 健康牙釉質(zhì)的能譜譜圖和成分比例

圖4 牙結(jié)石的能譜譜圖和成分比例

圖5 牙結(jié)石(有顆粒處)的能譜譜圖和成分比例

圖6 齲齒的能譜譜圖和成分比例

2.2 相關(guān)分析方法與相關(guān)系數(shù)

采用SPSSAU對(duì)觀測(cè)樣品的表征指標(biāo)P/Ca原子數(shù)量比進(jìn)行Pearson線性相關(guān)分析,置信區(qū)間0.05,Pearson相關(guān)系數(shù)r以及配對(duì)t檢驗(yàn)的差異性(p)見(jiàn)表2。

表2 Pearson相關(guān)系數(shù)r以及配對(duì)t檢驗(yàn)的差異性

2.3 結(jié)果與討論

2.3.1 P/Ca原子比

(1)羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的理論P(yáng)/Ca原子比數(shù)量為0.6[4],本研究能譜分析參照樣品(商品羥基磷灰石,圖1和表1)的P/Ca極小值和極大值為0.576 1,0.637 5,均值0.600 3,標(biāo)準(zhǔn)差0.024 4,極值浮動(dòng)一方面源于樣品的位置、尺寸、形貌等差異對(duì)能譜信號(hào)的影響以及軟件擬合方式對(duì)P/Ca原子數(shù)量比產(chǎn)生的誤差。另一方面參照樣品本身亦非理想純凈,或本身原子比存在不均勻性。但浮動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)差0.024 4不大,均值基本上與理論值等同,如此將其作為參考分析對(duì)象可行。

(2)健康牙釉質(zhì)(圖3和表1)的P/Ca原子數(shù)量比均值0.614 8、大于參照樣品2.4%,極小值0.575 8小于參照樣品0.05%,極大值0.663 9大于參照樣品4.1%,表面看兩者P/Ca原子數(shù)量比差異小至10-2數(shù)量級(jí),但兩者的標(biāo)準(zhǔn)差0.029 7與0.024 4的相差幅度達(dá)21.7%,即上升至10-1數(shù)量級(jí)。由此推論,在健康牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)中,P/Ca原子數(shù)量比相對(duì)參照樣品的分散性顯著,這反映出健康牙釉質(zhì)本身晶體結(jié)構(gòu)應(yīng)不會(huì)是純粹的羥基磷灰石,內(nèi)部還可能有其他鈣/磷化合物存在。另外,本實(shí)驗(yàn)對(duì)健康牙釉質(zhì)除測(cè)到P、Ca、O元素外,還檢測(cè)到少量的Na和Mg[5],雖然Na的原子占數(shù)量比未超過(guò)1.2%,Mg未超過(guò)0.4%,但若Na+和Mg2+替換Ca10(PO4)6(OH)2結(jié)構(gòu)中的Ca2+,因價(jià)態(tài)或原子尺寸差別,也有可能會(huì)引起PO43-/Ca2+的數(shù)量比例變化,即P/Ca原子數(shù)量比的變化。

(3)牙結(jié)石(圖4和表1)的P/Ca原子數(shù)量比均值0.689 1大于參照樣品14.8%,極小值0.395 3小于參照樣品31.4%,極大值0.823 5大于參照樣品29.2%,更有牙結(jié)石的標(biāo)準(zhǔn)差0.149 9五倍于參照樣品的標(biāo)準(zhǔn)差0.029 7。這些數(shù)據(jù)即顯示牙結(jié)石與參照樣品的結(jié)構(gòu)差異,明顯大于健康牙釉質(zhì)與參照樣品的結(jié)構(gòu)差異,也顯示出牙結(jié)石中P/Ca原子數(shù)量比的分散性非常劇烈,這正是牙結(jié)石之所以為牙垢、為口腔臟物的原因。另外,在本研究實(shí)驗(yàn)P/Ca原子數(shù)量比為極小值0.395 3牙結(jié)石樣本中,使用TIA軟件自動(dòng)計(jì)算出Na、Mg原子數(shù)量比分別為0.06%和0.01%;而在P/Ca原子數(shù)量比為極大值0.823 5牙結(jié)石樣本中,Na和Mg原子數(shù)量占比分別為1.05%和1.51%,說(shuō)明Ca2+與Na+(Mg2+)等正離子也有此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。實(shí)際上P/Ca原子數(shù)量比(0.421 2)接近極小值處牙結(jié)石樣本處,C含量最高(原子數(shù)量占比約56.43%,圖5),而且此處有部分納米顆粒析出(如圖7,HAADF-STEM形貌圖),在這個(gè)形貌圖中,Ca原子序數(shù)最大,相應(yīng)圖像亮度應(yīng)越大,推測(cè)圖中納米尺度的亮點(diǎn)可能是Ca或其化合物,其余主要為C元素。

圖7 有部分納米顆粒析出的HAADF-STEM形貌圖

(4)齲變牙釉質(zhì)(圖6和表1)P/Ca均值0.717 1大于健康牙釉質(zhì)和參照樣品16.6%,19.4%,極小值0.315 4小于健康牙釉質(zhì)和參照樣品45.2%,45.2%,極大值1.539 3大于健康牙釉質(zhì)和參照樣品131.8%,141.4%,,標(biāo)準(zhǔn)差0.252 4約8.5倍于健康牙釉質(zhì)0.029 7,約10.5倍參照樣品0.024 4。很明顯,齲齒的牙釉質(zhì)與健康牙釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異以及P/Ca原子數(shù)量比的分散性,相比牙結(jié)石更為顯著。

2.3.2 Pearson線性相關(guān)分析

根據(jù)表2對(duì)觀測(cè)樣品表征指標(biāo)P/Ca原子數(shù)量比進(jìn)行Pearson線性相關(guān)分析及其配對(duì)t檢驗(yàn)的差異性分析結(jié)果,可以認(rèn)為:

(1)齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的P/Ca原子數(shù)量比在0.05置信水平上顯著負(fù)相關(guān)(0.5≤|r=-0.734 3|≤1.0表示強(qiáng)相關(guān)),配對(duì)檢驗(yàn)差別統(tǒng)計(jì)不顯著(p>0.05)。

(2)參照樣品和牙結(jié)石、參照樣品和齲變牙釉質(zhì)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系,但是其配對(duì)T檢驗(yàn)均有顯著差異(p<0.05),說(shuō)明參照樣品和牙結(jié)石、參照樣品和齲變牙釉質(zhì)雖然均值差異顯著,但是每個(gè)數(shù)據(jù)之間相對(duì)獨(dú)立、無(wú)相關(guān)關(guān)系。

(3)參照樣品和健康牙釉質(zhì)、健康牙釉質(zhì)和牙結(jié)石、健康牙釉質(zhì)和齲變牙釉質(zhì)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系,且配對(duì)T檢驗(yàn)差別統(tǒng)計(jì)也不顯著(p>0.05)。

3 結(jié)論

(1)牙釉質(zhì)本身晶體結(jié)構(gòu)不是純粹的羥基磷灰石,實(shí)驗(yàn)除測(cè)到P、Ca和O,還測(cè)到少量的Na和Mg,或因Na+和Mg2+替換Ca10(PO4)6(OH)2結(jié)構(gòu)中的Ca2+引起P/Ca原子數(shù)量比的變化。

(2)牙結(jié)石有測(cè)到比較多C元素的區(qū)域,這與食物殘?jiān)?、人體細(xì)胞主要成分為C吻合。

(3)齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的P/Ca原子數(shù)量比,相比參照樣本和健康牙釉質(zhì)分散性顯著,齲變牙釉質(zhì)更甚。

(4)齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的P/Ca原子數(shù)量比在0.05置信水平上有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

所以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持酸源學(xué)說(shuō),牙菌斑、食物殘?jiān)榷逊e,若不及時(shí)清除慢慢形成牙結(jié)石、牙釉質(zhì)脫礦成齲。保持牙齒清潔衛(wèi)生、及時(shí)清理牙結(jié)石或有助于預(yù)防牙齒齲變。但是因?yàn)辇x變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的P/Ca原子數(shù)量比表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān),或許慢慢礦化的牙結(jié)石的P源和Ca源部分來(lái)自牙釉質(zhì),才會(huì)導(dǎo)致齲變牙釉質(zhì)和牙結(jié)石的P/Ca原子數(shù)量比此消彼長(zhǎng)。