王珺,馬苗

(南京正大天晴制藥有限公司,江蘇 南京 210046)

利伐沙班(Rivaroxaban)是由德國(guó)拜耳和美國(guó)強(qiáng)生聯(lián)合研發(fā)的一種新型口服抗凝血藥物,商品名為拜瑞妥(Xarelto),于2008年10月在加拿大和歐盟獲得批準(zhǔn)上市,2011年7月在美國(guó)上市,2009年6月在中國(guó)正式上市[1-3]。臨床上主要用于擇期髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的成年患者,以預(yù)防靜脈血栓形成(VTE);用于治療成人靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE);用于具有一種或多種危險(xiǎn)因素的非瓣膜性房顫成年患者,以降低卒中和體循環(huán)栓塞風(fēng)險(xiǎn)。臨床試驗(yàn)表明,作為新型的口服抗凝藥物比華法林效果更佳,既可預(yù)防和治療靜脈血栓,又可預(yù)防和治療動(dòng)脈血栓,在臨床上獲得廣泛的應(yīng)用,2022年其在全球銷售額達(dá)到72億美元,具有良好的市場(chǎng)價(jià)值。

利伐沙班原料工業(yè)化合成路線文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道較多,甲胺作為利伐沙班中間體合成工藝中重要溶劑,在多條工業(yè)化合成路線中均有使用,其可能殘留到原料藥中,因此有必要對(duì)其殘留量進(jìn)行檢測(cè)和控制。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4-6],均未見(jiàn)利伐沙班原料藥中的甲胺檢測(cè)方法的報(bào)道。甲胺為含氮有機(jī)胺,極性較大,水溶液為中強(qiáng)堿,易揮發(fā),分析檢測(cè)具有一定的困難,文獻(xiàn)中多采用離子色譜法或采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定[7-9],建立了一種靈敏有效的頂空氣相色譜法測(cè)定甲胺殘留量,實(shí)驗(yàn)表明該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高且適用性強(qiáng),可作為利伐沙班原料藥中甲胺的測(cè)定方法,為質(zhì)量控制提供新的技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

氣相色譜儀(Agilent 7890B)配氫焰離子化檢測(cè)器(FID)、頂空進(jìn)樣器(Agilent 7897A),電子分析天平(Mettler Toledo XP205DR型,精確度:0.000 01 g)。

1.2 試藥

利伐沙班(批號(hào):170301、170302、170303,南京正大天晴制藥有限公司);甲胺水溶液(分析純,國(guó)藥集團(tuán),含量:26.6%,批號(hào):20170314);甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜(色譜純,TEDIA);乙醇、二氯甲烷(色譜純,ROE);甲苯(色譜純,Merck);N,N-二異丙基乙胺(分析純,北京百靈威)、丙酮、氫氧化鈉;(分析純,國(guó)藥集團(tuán));超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent CP-Volamine(30 m×0.32 mm);程序升溫(起始溫度為35 ℃,維持8 min,以每分鐘25 ℃的速率升溫至200 ℃,維持6 min);載氣為氮?dú)?柱流量1.5 mL/min;FID檢測(cè)器溫度220 ℃;頂空進(jìn)樣,頂空瓶平衡溫度90 ℃,平衡時(shí)間30 min;進(jìn)樣口溫度200 ℃;分流比20∶1。

2.2 溶液的制備

溶劑:二甲基亞砜-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比95∶5)。

甲胺對(duì)照品貯備液Ⅰ:取甲胺溶液適量,精密稱定,用溶劑定量稀釋制成每1 mL中約含250 μg的溶液。

甲胺對(duì)照品貯備液:精密量取甲胺對(duì)照品貯備液Ⅰ,加溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液。

供試品貯備液:取利伐沙班適量,精密稱定,加溶劑適量振搖使溶解,用溶劑稀釋制成每1 mL中約含0.1 g的溶液。

甲胺對(duì)照品溶液:精密量取甲胺對(duì)照品貯備液1 mL,置頂空瓶中,再精密加供試品貯備液1 mL,搖勻,密封,即得。

供試品溶液:精密量取供試品貯備液1 mL,置頂空瓶中,再精密加溶劑1 mL,搖勻,密封,即得。

各潛在溶劑貯備液:分別取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、甲苯、醋酸、N,N-二甲基甲酰胺與N,N-二異丙基乙胺各適量,用溶劑定量稀釋制成每1 mL中約含甲醇15 mg、乙醇25 mg、丙酮25 mg、二氯甲烷3 mg、甲苯4.45 mg、醋酸25 mg、N,N-二甲基甲酰胺4.4 mg與N,N-二異丙基乙胺5 mg的溶液,即得。

混合溶劑對(duì)照溶液:精密量取“2.2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品貯備液Ⅰ 2 mL、“2.2.7”項(xiàng)各潛在溶劑貯備液各0.2 mL,置同一10 mL量瓶中,加溶劑稀釋至刻度,搖勻;精密量取1 mL,置頂空瓶中,再精密加入供試品貯備液1 mL,搖勻,密封,即得。

各溶劑定位溶液:分別量取“2.2.7”項(xiàng)下各潛在溶劑貯備液各0.2 mL,置不同的10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,分別精密量取1 mL,置頂空瓶中,再分別精密加入供試品貯備液1 mL,搖勻,密封,即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取空白溶劑、甲胺對(duì)照品溶液、混合溶劑對(duì)照溶液和供試品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,空白溶劑和合成過(guò)程中潛在殘留溶劑均不干擾甲胺檢測(cè),甲胺與其他殘留溶劑均能有效分離,分離度遠(yuǎn)大于1.5,本方法專屬性良好。

A．空白溶劑;B．混合對(duì)照品溶液;C．甲胺對(duì)照溶液;1．甲胺;2．甲醇;3．乙醇;4．丙酮;

5．二氯甲烷;6．

N

,

N

-二甲基甲酰胺;7．甲苯;8．

N

,

N

-二異丙基乙胺。

圖1 專屬性試驗(yàn)氣相色譜圖

2.3.2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果6次峰面積RSD為1.4%,保留時(shí)間的RSD為0.0%,表明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品溶液配制方法逐級(jí)稀釋配制定量限溶液(信噪比要求為10∶1)和檢測(cè)限溶液(信噪比要求為3∶1),頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,定量限濃度為0.80 μg/mL,相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.002%,峰面積平均值為1.44,峰面積RSD為19%,保留時(shí)間RSD為0.1%,檢測(cè)限質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL。結(jié)果表明方法靈敏度高,可以用于甲胺殘留的檢測(cè)。

2.3.4 線性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品貯備液Ⅰ 0.5,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5 mL,分別置25 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,制成系列濃度的線性貯備液。分別精密移取系列濃度的線性貯備液1 mL,分別置頂空瓶中,再精密加入供試品貯備液1 mL,搖勻,密封,制成相當(dāng)于限度濃度的10%～250%系列線性溶液,每個(gè)濃度水平溶液平行制備2份,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸分析,得到甲胺的線性回歸方程為y=4.458 5x-8.627 4,相關(guān)系數(shù)r=0.999 6,y軸截距偏差為7.7%,響應(yīng)因子RSD為23.6%,結(jié)果表明甲胺在2.50～62.45 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別取供試品各1.0 g,精密稱定,置10 mL量瓶中,加溶劑5 mL使溶解,分別加入“2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品貯備液Ⅰ1.0,2.0,3.0 mL,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,制成三個(gè)不同濃度的加標(biāo)供試品溶液貯備液,分別取加標(biāo)供試品溶液貯備液各1 mL,置頂空瓶中,再分別精密加溶劑1 mL,搖勻,密封,配制成相當(dāng)于甲胺限度濃度的50%,100%,150%加標(biāo)供試品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。結(jié)果表明,甲胺的回收率在89.9%～104.0%范圍內(nèi),平均回收率為97.5%,RSD為6.5%,該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3.5”項(xiàng)下配制方法平行制備6份含100%限度濃度甲胺加標(biāo)供試品溶液和對(duì)照品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。按標(biāo)準(zhǔn)加入法以峰面積計(jì)算甲胺含量,加標(biāo)供試品溶液測(cè)定結(jié)果平均值為0.045%,RSD為9.8%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn)

為考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響,另一名分析員在不同的時(shí)間使用不同儀器獨(dú)立建立系統(tǒng),按“2.3.6”項(xiàng)下方法重新制備6份加標(biāo)供試品溶液和對(duì)照品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。按標(biāo)準(zhǔn)加入法以峰面積計(jì)算甲胺含量,計(jì)算不同人員在不同時(shí)間使用不同儀器測(cè)定結(jié)果的RSD。12次測(cè)定結(jié)果平均值為0.046%,RSD為12.8%,結(jié)果表明本方法的中間精密度良好。

2.3.8 耐用性試驗(yàn)

按“2.3.5”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液配制方法制備含100%限度濃度甲胺加標(biāo)供試品溶液和對(duì)照品溶液,作為耐用性測(cè)試溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,對(duì)色譜條件中的參數(shù)做微小的變動(dòng),分別改變起始柱溫30,40 ℃,載氣流速1.0,2.0 mL/min,分流比15∶1,25∶1,頂空瓶平衡溫度85,95 ℃,頂空瓶平衡時(shí)間25,35 min,進(jìn)樣口溫度195,205 ℃和檢測(cè)器溫度215,225 ℃,取加標(biāo)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析,各條件下甲胺對(duì)照品溶液甲胺峰理論板數(shù)均大于20 000、甲胺峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5,不同條件下供試品溶液中甲胺測(cè)定結(jié)果與規(guī)定條件下測(cè)定結(jié)果的比值在79.4%～97.8%之間,均能滿足測(cè)定要求,表明本方法耐用性良好。

2.3.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下甲胺對(duì)照品溶液和供試品溶液,立即頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,置室溫下放置,分別于第4,8,12,16,24 h進(jìn)樣分析,各時(shí)間點(diǎn)甲胺峰面積與0 h峰面積比值在91.8%～100.7%之間,峰面積的RSD為4.3%;供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi),均未檢出甲胺峰,且未出現(xiàn)新雜質(zhì)峰干擾甲胺的測(cè)定,結(jié)果表明甲胺對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,可以滿足檢測(cè)需求。

2.3.10 樣品測(cè)定

取三批利伐沙班原料藥(批號(hào):批號(hào):170301、170302、170303),分別按照“2.2”項(xiàng)下配制供試品溶液和甲胺對(duì)照品溶液,頂空進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,按標(biāo)準(zhǔn)加入法以峰面積計(jì)算甲胺含量,三批供試品中均未檢出甲胺。

3 討論

3.1 甲胺限度的制定

目前《中國(guó)藥典》2020年版四部通則《0861殘留溶劑測(cè)定法》[10]和ICH Q3C(R7)《雜質(zhì):殘留溶劑的指導(dǎo)原則》[11]中均未收載甲胺的限度要求,文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道按照鑒定限度0.10%來(lái)控制原料中甲胺殘留量,《美國(guó)藥典》40(USP 40)中Gadodiamide(釓雙胺)原料中甲胺控制限度為不得過(guò)0.05%[12],為了保證藥品的安全性,嚴(yán)格控制利伐沙班中甲胺殘留量,因此將甲胺的限度擬定為0.05%。

3.2 色譜柱的選擇

根據(jù)待測(cè)溶劑甲胺的性質(zhì),其為含氮有機(jī)胺,極性較大,水溶液為中強(qiáng)堿,易揮發(fā),本方法建立過(guò)程中分別考察了不同色譜柱,最終選擇了揮發(fā)性胺類專用色譜柱Agilent CP-Volamine(30 m×0.32 mm)進(jìn)行分析,其內(nèi)部具有非極性固定相涂層,憑借多功能脫活技術(shù)可以獲得對(duì)稱的峰形,即使在樣品水分含量很高時(shí)仍然可以獲得滿意的結(jié)果。

3.3 溶劑的選擇

根據(jù)利伐沙班的溶解性特點(diǎn),其屬于難溶性藥物,在水及常規(guī)有機(jī)溶劑中的溶解度均較差,參考文獻(xiàn)[4-5]篩選溶劑,優(yōu)選二甲基亞砜(DMSO)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)為候選供試品配制溶劑?？紤]到甲胺為有機(jī)胺,水溶液為中強(qiáng)堿,在原料中可能會(huì)以鹽的形式存在,游離揮發(fā)較少,給檢測(cè)分析帶來(lái)困難,為提高檢測(cè)效率和靈敏度,嘗試在溶劑中加入一定量氫氧化鈉溶液來(lái)提高檢測(cè)靈敏度,本方法建立過(guò)程中考察了溶劑①二甲基亞砜-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比90∶10)、②N-甲基吡咯烷酮-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比90∶10)、③二甲基亞砜-1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比99∶1)、④二甲基亞砜-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比95∶5)、⑤二甲基亞砜-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(體積比98∶2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)利伐沙班在溶劑①、②中不能完全溶解,在溶劑③中放置一段時(shí)間后析出,溶劑④中比溶劑⑤甲胺峰形更好,且有助于甲胺的測(cè)定,因此選擇溶劑④作為配制溶劑。

3.4 進(jìn)樣方式的選擇

考慮到在溶劑中加入強(qiáng)堿氫氧化鈉來(lái)增加甲胺測(cè)定的靈敏度,采用直接進(jìn)樣方式對(duì)儀器進(jìn)樣口和色譜柱會(huì)有一定的污染,優(yōu)先采用頂空進(jìn)樣方式測(cè)定殘留溶劑。

3.5 定量計(jì)算方式的選擇

外標(biāo)法為殘留溶劑測(cè)定中常用的定量方法,本方法建立過(guò)程中嘗試采用外標(biāo)法定量,在準(zhǔn)確度試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)供試品與對(duì)照品處于不完全相同的基質(zhì)中,存在氣液平衡過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng),加標(biāo)供試品中甲胺峰面積為對(duì)照品溶液中甲胺峰面積的85%左右,因此選擇標(biāo)準(zhǔn)加入法定量來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,使定量結(jié)果更準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

本文所建立的測(cè)定利伐沙班原料藥中甲胺殘留量的方法可確保甲胺色譜峰和原料中其他潛在溶劑色譜峰的分離度滿足氣相色譜測(cè)定要求,專屬性良好,操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好,能夠滿足日常藥品質(zhì)量控制的需要,對(duì)于保障藥品質(zhì)量和用藥安全具有重要的意義,也可為其他原料中甲胺的測(cè)定提供了參考。