陳云秀,沈幼紅,宋慧慧,李恒,檀璐陽(yáng),賈飛,婁曉芬*

(1.大紅鷹藥業(yè)股份有限公司 藥物研發(fā)中心,浙江 寧波 315040;2.杭州百誠(chéng)醫(yī)藥科技股份有限公司,浙江 杭州 310000)

高血壓是一個(gè)全球性健康問題,是導(dǎo)致心臟病和中風(fēng)的主要因素。如果患者的血壓不能被控制,與之相關(guān)聯(lián)的中風(fēng)和冠狀動(dòng)脈病的患病風(fēng)險(xiǎn)也將隨之增加[1]。苯磺酸氨氯地平作為新一代二氫吡啶類鈣通道阻滯劑,為長(zhǎng)效抗高血壓藥物,可有效防止鈣離子跨膜流入到心肌和血管平滑肌,使外周動(dòng)脈血管產(chǎn)生擴(kuò)張作用。苯磺酸氨氯地平對(duì)原發(fā)性高血壓和心絞痛具有良好的治療效果[2-3]。苯磺酸氨氯地平化學(xué)名稱:(±)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-1,4-二氫-6-甲基-3,5-吡啶二羧酸-5-甲酯,3-乙酯苯磺酸鹽。

近年來,藥物成分和藥品中潛在的致突變雜質(zhì)問題備受關(guān)注,制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到潛在致突變雜質(zhì)對(duì)人類健康和監(jiān)管問題的重要性。歐洲藥品管理局(EMA)、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)及人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)先后頒了潛在致突變雜質(zhì)控制的指導(dǎo)文件,推薦按毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC,1.5 μg/d)來控制用藥風(fēng)險(xiǎn)[4],TTC 1.5 μg/(人·d)是被可接受的風(fēng)險(xiǎn)范圍。然后通過適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法檢測(cè)藥物中潛在致突變雜質(zhì)的種類和含量,確保藥品質(zhì)量。

通過查閱苯磺酸氨氯地平的合成文獻(xiàn)[5-6]可知,該合成工藝過程中可能會(huì)有潛在致突變雜質(zhì)生成,其中苯磺酸酯類致突變雜質(zhì)[7]的研究已有相關(guān)報(bào)道,此處不再詳細(xì)描述。對(duì)照致突變警示結(jié)構(gòu)[8-9],我們對(duì)其他可能的潛在致突變雜質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估分析,并開展相關(guān)研究工作。應(yīng)用TOXTREE和VEGA軟件對(duì)可能具有致突變警示結(jié)構(gòu)的反應(yīng)物料和中間體進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬的毒性評(píng)估。結(jié)果顯示,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(合成中間體)KNN/Reas-Across評(píng)估結(jié)果呈Ames陽(yáng)性,為可能的潛在致突變雜質(zhì)。具體評(píng)估結(jié)果如表1所示。

基于TTC,根據(jù)苯磺酸氨氯地平每日最大服用劑量為10 mg可知,潛在致突變雜質(zhì)乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(本品為高血壓長(zhǎng)期治療用藥物,服藥周期長(zhǎng),按照服藥期間超過10年計(jì)算)的可接受限度:(1.5 μg/d)÷(0.01 g/d) =150×10-6。

本研究主要通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯雜質(zhì)進(jìn)行分離和測(cè)定,并按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

表1 潛在致突變雜質(zhì)評(píng)估結(jié)果

1 儀器與試藥

1.1 儀器、設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛, U3000+ISO);電子天平(賽多利斯,Secura 125-CN);超聲儀(GC Sonic,VGT)。

1.2 試劑、試液

甲酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,AR級(jí));乙腈(TEDIA,HPLC級(jí)),乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯對(duì)照品(上海畢得醫(yī)藥科技有限公司,97.52%);苯磺酸氨氯地平(寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱:填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(Agilent Zorbax SB-C184.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5 min,B相從50%線性升至90%;5～7 min,B相保持90%;7～7.1 min,B相從90%線性將至50%;7.1～12 min,B相保持50%。

2.2 質(zhì)譜條件

裂解方式:碰撞誘導(dǎo)解離(CID);霧化溫度:450 ℃;離子傳輸管溫度:300 ℃;正離子電壓:3 000 V;負(fù)離子電壓:-2 000 V;鞘氣:65 psi;輔助氣:9 psi;吹掃氣:0.5 psi;掃描名稱:1;質(zhì)量列表或范圍(amv):320;極性離子:陽(yáng)性;源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓:20 V。

2.3 濃度計(jì)算

精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品色譜圖中如有與待測(cè)成分保留時(shí)間一致的色譜峰,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,樣品中乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯不超過0.015%(即150×10-6)。

3 方法學(xué)考察

3.1 對(duì)照品及供試品溶液配制

稀釋劑(空白溶液)為90%乙腈。

精密稱取本品適量,用稀釋劑溶解并定量稀釋成每1 mL約含1 mg的溶液作為供試品溶液(濃度1.0 mg/mL)。

精密稱取乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯適量,用稀釋劑溶解,并稀釋配成每1 mL約含1.5 μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.5 μg/mL)。取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用稀釋劑稀釋配成每1 mL約含0.15 μg的溶液作為對(duì)照品溶液(0.15 μg/mL)。

精密稱取樣品適量置于量瓶中,加入適量稀釋劑溶解后再加入對(duì)照品儲(chǔ)備液,用稀釋劑稀釋至刻度,作為加標(biāo)供試品溶液(溶液中樣品濃度為1.0 mg/mL,對(duì)照品質(zhì)量濃度為0.15 μg/mL)。

3.2 系統(tǒng)適用性與儀器精密度

取對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次,計(jì)算峰面積RSD和保留時(shí)間RSD,考察系統(tǒng)適用性和儀器精密度。結(jié)果顯示,6次測(cè)定的峰面積RSD為1.2%,保留時(shí)間RSD為0.1%,表明系統(tǒng)適用性和儀器精密度良好。

3.3 專屬性

精密量取“3.1”節(jié)項(xiàng)下的溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,空白溶液無干擾。供試品溶液、加標(biāo)供試品溶液與對(duì)照品溶液待測(cè)峰保留時(shí)間一致,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯與各雜質(zhì)峰能有效分離,該方法專屬性良好。

3.4 檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋,按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣,取基線噪聲的3倍以上(信噪比S/N≥3)值作為最低檢測(cè)限,取基線噪聲的10倍(信噪比S/N≈10)值作為最小定量限。檢測(cè)限為0.009 2 ng,定量限為0.030 5 ng。

色譜圖如下:

圖1 檢測(cè)限和定量限圖譜

3.5 線性和范圍

取對(duì)照品儲(chǔ)備液,用稀釋劑稀釋成質(zhì)量濃度為0.003 1,0.030 5,0.076 3,0.122 0,0.152 5,0.228 8 μg/mL的線性溶液,分別取上述溶液,按照“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積,以濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性曲線方程為y=27 384.531 2x+31.838 0,相關(guān)回歸系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯在0.003 1～ 0.228 8 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

3.6 準(zhǔn)確度

取苯磺酸氨氯地平樣品和對(duì)照品貯備液,用稀釋劑配制成LOQ:50%,100%,120%水平體積分?jǐn)?shù)溶液。每種水平溶液平行配制3份,分別測(cè)定其含量,將實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行比較,計(jì)算回收率。結(jié)果如表2所示,LOQ水平回收率RSD=4.1%,50%～120%水平回收率RSD=2.8%。結(jié)果表明本方法可準(zhǔn)確測(cè)定供試品溶液中乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯的量,準(zhǔn)確度良好。

表2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果——準(zhǔn)確度

3.7 精密度

3.7.1 重復(fù)性

平行配制6份加標(biāo)供試品溶液,由同一分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算測(cè)得量及RSD。結(jié)果顯示,重復(fù)性6份樣品溶液測(cè)得量RSD為2.4%,該方法具有良好的重復(fù)性。

3.7.2 中間精密度

配制6份加標(biāo)供試品溶液,由另一名分析員在不同的日期進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算測(cè)得量及RSD,同時(shí)與重復(fù)性試驗(yàn)共12份測(cè)定結(jié)果合并計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,中間精密度6份樣品溶液測(cè)定結(jié)果RSD為1.7%;重復(fù)性與中間精密度結(jié)果合并計(jì)算,12份樣品中測(cè)定結(jié)果RSD為2.2%,該方法的精密度良好。

表3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果——中間精密度

3.8 耐用性

3.8.1 溶液穩(wěn)定性

精密量取“3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液,分別于0,4,8,15,25 h進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖,計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果顯示,不同時(shí)間色譜峰面積基本一致,對(duì)照品峰面積RSD=9.2%,加標(biāo)供試品溶液峰面積RSD=9.3%。表明對(duì)照品溶液室溫放置25.0 h穩(wěn)定,加標(biāo)供試品溶液室溫放置24.8 h穩(wěn)定。

3.8.2 耐用性研究-色譜條件變動(dòng)

取“3.1”項(xiàng)下空白溶液(稀釋劑)、供試品溶液、對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液(平行兩份)各10 μL,按“2.1”節(jié)的色譜條件進(jìn)樣。通過改變柱溫(30±5)℃、初始梯度((50∶50)±5%)、柱流速(1.0±0.2)mL/min、流動(dòng)相A甲酸加入量(1 000±200) μL/(1 000 mL)等條件,考察測(cè)定組分測(cè)得量與初始條件下測(cè)得量的RSD。結(jié)果如表4所示。

表4 方法學(xué)驗(yàn)證——耐用性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,柱流速0.8～1.2 mL/min條件下,加標(biāo)供試品溶液中測(cè)得量RSD=2.9%;初始梯度V(A)∶V(B)=45∶55～55∶45條件下,加標(biāo)供試品溶液中測(cè)得量RSD=3.3%;柱溫25～35 ℃條件下,加標(biāo)供試品測(cè)得量RSD=2.7%;甲酸加入量0.08%～0.12%條件下,加標(biāo)供試品溶液測(cè)得量RSD=2.5%。結(jié)果表明該方法對(duì)流速、初始梯度、柱溫、流動(dòng)相A中甲酸加入量的微小變化耐用。

3.9 樣品測(cè)定結(jié)果

取9批苯磺酸氨氯地平原料藥,按照“3.1”節(jié)項(xiàng)下配制樣品溶液,并按照“2.1”節(jié)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別測(cè)定乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯含量,檢測(cè)結(jié)果顯示,多批次樣品中均未檢出該雜質(zhì),即雜質(zhì)在原料藥中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于M7指導(dǎo)原則中潛在致突變雜質(zhì)的限度。

4 結(jié)果討論

高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法具有簡(jiǎn)單高效、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),可以對(duì)樣品中的雜質(zhì)殘留進(jìn)行有效地檢測(cè)和分析。

該方法可以在較短時(shí)間(雜質(zhì)出峰時(shí)間在4.7 min左右)內(nèi)對(duì)苯磺酸氨氯地平中潛在致突變雜質(zhì)乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯進(jìn)行有效檢測(cè)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,該方法耐用性良好,可有效用于常規(guī)的樣品檢測(cè),確保該方法的數(shù)據(jù)可靠性。本方法能保證雜質(zhì)殘留的可控性,為苯磺酸氨氯地平的質(zhì)量控制和后續(xù)研究提供有力保障。