陶琳,趙晗宇,劉朝青,張芳

(1.南昌弘益藥業(yè)有限公司,江西 南昌 330096;2.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330004)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是指伴有上腹痛、脹,噯氣,食欲不振等臨床癥狀的一種臨床常見功能性胃腸病,可分為運動障礙型、潰瘍型及非特異型[1]。全世界FD的患病率較高,西方國家約10%～40%,亞洲國家約5%～30%[2]。而FD發(fā)病機制并未明確。西醫(yī)多認為FD與腸胃動力障礙、內(nèi)臟敏感過度、社會心理因素、十二指腸黏膜病癥、幽門螺旋桿菌感染等有關[3]。

在FD的治療上,中醫(yī)認為宜在通利消滯和胃降逆的基礎上,佐以清熱解郁之劑。達立通顆粒處方則是根據(jù)古人“腑氣以通為用”的原則研制而來,處方是由柴胡、枳實、木香、陳皮、清半夏、焦山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索、六神曲、蒲公英組成,方中12味中藥材都具有調(diào)節(jié)胃腸功能、促進消化之功效。

網(wǎng)絡藥理學是近年來興起的一門具有“多基因、多靶點”特點的藥理學分支學科,展示了疾病與相關靶點的復雜關系,為疾病發(fā)病機制與治療提供新思路,是中藥學科研究的前沿和焦點。本文對達立通顆粒進行網(wǎng)絡藥理學分析,探究達立通顆粒對FD得作用機制。

1 資料與方法

將達立通顆粒中12味中藥名稱輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻檢索,搜集12味中藥材的活性化學成分,篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%,成藥相似性(DL)≥0.18,將活性化學成分2D結(jié)構(gòu)輸入Swiss Institute of Bioinformatics數(shù)據(jù)庫中進一步篩選。將搜集到的活性化學成分通過PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss Institute of Bioinformatics數(shù)據(jù)庫中的SwissTargetPrediction進行潛在靶點的搜集。通過網(wǎng)絡圖像化軟件Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“活性化學成分靶點”互相作用網(wǎng)絡圖。采用DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、GENECARDS數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫,在數(shù)據(jù)庫中搜集與FD相關的靶點基因,整理后建立FD相關靶點數(shù)據(jù)集。剔除重復靶點后,經(jīng)過Venn分析,得到達立通顆粒潛在作用FD靶點基因,構(gòu)建“中藥-化學成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡圖。用數(shù)據(jù)庫String檢索潛在作用FD的靶點基因,得到蛋白之間的互相作用信息,通過Cytoscape3.7.2軟件對靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關系(PPI)網(wǎng)絡進行分析。將疾病-藥物成分共同靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫,進行GO功能富集分析,選擇生物過程(biological process,BP)/細胞組(cell component,CC)/分子功能(molecμLar function,MF)排名前十的通路,繪制條形圖;進行KEGG信號通路富集分析,設置P<0.05,剔除廣泛通路后,得到排名靠前的重要通路繪制氣泡圖。通過PDB數(shù)據(jù)庫和ZINC數(shù)據(jù)庫分別搜集度值(degree)排名靠前的蛋白質(zhì)和小分子配體,AutoDockTools1.5.6進行分子對接(若結(jié)合能<0,表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合),并將打分結(jié)果通過GraphPad Prism8生成熱圖,將打分最高的結(jié)果通過PyMol2.5生成分子對接圖。

2 結(jié)果

2.1 主要活性化學成分的篩選與搜集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻報道,經(jīng)OB、DL條件按篩選共得到活性化學成分71個(圖1)。

圖1 達立通顆粒活性化學成分網(wǎng)絡

2.2 活性化學成分潛在靶點的搜集

通過數(shù)據(jù)庫檢索得到活性化學成分去重后對應的903個作用靶點。通過軟件Cytoscape3.7.2將候選活性成分和靶點相連,該網(wǎng)絡由984個節(jié)點,6 771條邊(圖2)。

圖2 達立通顆?！盎钚曰瘜W成分靶點”相互作用網(wǎng)絡

2.3 FD疾病靶點的搜集及與達立通顆粒作用靶點Venn分析

通過DRUGBANK等數(shù)據(jù)庫建立FD相關靶點數(shù)據(jù)集,剔重之后,共搜集到592個FD疾病相關靶點。經(jīng)過Venn分析活性成分對應的903個作用靶點與592個FD疾病相關靶點,得到達立通顆粒潛在作用FD的133個靶點基因。進而運用Cytoscape3.7.2軟件得“中藥-化學成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡圖(圖3)。

圖3 “中藥-化學成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡圖

2.4 生物分子網(wǎng)絡建立

通過String數(shù)據(jù)庫檢索133個Venn分析得到得靶點,利用軟件Cytoscape對靶點PPI網(wǎng)絡進行分析。其中degree排名前5的靶點為PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC,可認為是達立通顆粒治療FD的核心靶點(圖4)。

圖4 靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關系圖

2.5 富集分析

將核心靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能、KEGG通路分析,GO功能分析的BP/CC/MF各有133個生物過程,選取各排名前十的通路做條形圖。其中BP富集結(jié)果有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細胞增殖正調(diào)控等。CC富集結(jié)果有質(zhì)膜、細胞核等。MF富集結(jié)果有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等。

KEGG信號通路富集分析得到125條通路,選取排名靠前的20條富集較大通路做圖(圖5)。富集結(jié)果所涉及通路有PI3K/AKT信號通路、Rap 1信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT通路等。

圖5 EGG信號通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果分析

選取五個關鍵靶點與五個活性有效成分進行分子對接,繪制熱圖(圖6)。由圖可知:MAPK1和山柰酚(kaempferol)結(jié)合力最高,打分為-3.38,其次是SRC和橙皮素(Hesperetin)為-2.94。并給予結(jié)合能力最高的MAPK1與山柰酚繪制分子對接圖(圖7)。

圖6 分子對接打分熱圖

圖7 MAPK1和山柰酚分子對接圖

3 討論與小結(jié)

本研究通過數(shù)據(jù)庫和文獻報道,篩選后得到達立通顆?；钚曰瘜W成分71個。在133個與FD有關的潛在靶基因中,黃酮類活性成分作用靶點占絕大部分,如山柰酚、橙皮素、槲皮素等。黃酮類化合物在自然界分布廣泛,且對于功能性消化不良患者治療效果顯著[4]。

從PPI圖可知degree排名前5的靶點分別為PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC。在KEGG通路富集中,所涉及通路有PI3K/AKT通路、Rap 1通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等。

PIK3CA作用于PI3K-AKT通路。AKT1為AKT類型之一,是PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)的重要一環(huán)[5]。響應細胞外信號,PI3K-ATK通路通過磷酸化調(diào)控其下游通路eNOS,產(chǎn)生NO。在FD發(fā)病機制中NO和其代謝物的影響極為重要,作用于胃腸道平滑肌,導致胃腸道蠕動減少[6]。AKT的表達可激活NF-κB(核因子κB),加強釋放炎癥因子,引起胃黏膜損傷[7]。

STAT3經(jīng)刺激后可作用于Jak/STAT通路調(diào)節(jié)多種基因表達。十二指腸、抑郁與FD發(fā)病有關,FD患者伴隨十二指腸的低度炎癥且更易產(chǎn)生抑郁傾向[8-9]。分布廣泛的Jak/STAT信號通路是參與免疫反應、炎癥反應的重要部分,有實驗表明,調(diào)節(jié)此通路,可降低炎癥因子水平,促進腸黏膜修復減輕損傷[10],可降低中樞炎癥反應,產(chǎn)生抗抑郁作用[11]。

MAPK1(又稱ERK2)為MAPK信號傳導的關鍵調(diào)節(jié)因子。Rap 1主要是影響ERK信號傳導通路調(diào)控基因表達[12]。ERK通路是MAPK諸多通路之一,參與炎癥反應且與抑郁相關。MAPK通路通過磷酸化ERK1/2等信號分子,進而調(diào)節(jié)相關炎癥因子表達。在FD發(fā)病表現(xiàn)中,上腹痛癥狀與幽門螺旋桿菌感染最相關[13],幽門螺旋桿菌可通過激活ERK1/2信號通路,引起炎癥因子過度表達,胃黏膜產(chǎn)生持續(xù)損傷[14]。ERK1/2信號通路調(diào)控下游腦源性神經(jīng)影響因子表達,可對抑郁產(chǎn)生影響[15]。

經(jīng)以上分析可知,關鍵靶點分別與富集較大通路相對應,PI3K-AKT信號通路參與炎癥反應,調(diào)節(jié)產(chǎn)生NO,影響胃腸道動力。Jak-STAT信號通路調(diào)節(jié)炎癥因子水平,影響?zhàn)つp傷,改善抑郁。MAPK信號通路可調(diào)控炎癥反應,抑郁和疼痛敏化。結(jié)合分子對接結(jié)果表明活性成分與作用靶點結(jié)合能力強,表明運用網(wǎng)絡藥理學對達立通顆粒治療FD作用機制研究可行。

綜上所述,本研究提示達立通顆?；钚猿煞肿饔糜赑IK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1等相關靶點,通過PI3K/AKT通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等多個通路,調(diào)節(jié)炎癥反應、胃腸動力、抑郁情緒等作用治療FD。揭示了達立通顆粒治療FD的復雜分子網(wǎng)絡關系,從理論層潛在分析了達立通顆粒治療FD的作用機制,體現(xiàn)了達立通顆粒多成分、多靶點、多通路協(xié)同治療FD的特點,為中醫(yī)藥治療FD的作用機制提供科學依據(jù)。但本研究僅在網(wǎng)絡藥理學的基礎上預測藥物對疾病的作用機制,還需進行相關實驗,深入探究其具體作用機制。