武濤,張絢,劉慧,劉菲,郝婷婷,韓婷婷,楊素珍

(福瑞達(dá)生物股份有限公司,山東 濟(jì)南 250101)

重點(diǎn)綜述了近年來關(guān)于沒食子酸乙酯生物活性的相關(guān)研究。沒食子酸乙酯(Ethyl gallate,EG),屬沒食子酸烷基酯的一種,化學(xué)名為3,4,5-三羥基苯甲酸乙酯,白色結(jié)晶粉末,溶點(diǎn)149～153 ℃,可溶于水。EG主要存在于鉤錐葉、余甘子果實(shí)、小果薔薇根、五倍子根部和芍藥等中草藥植物,具有廣泛的生物活性,能夠有效清除自由基,抑制炎性細(xì)胞激活,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等,涉及眾多與疾病防治相關(guān)的研究領(lǐng)域,圖1為EG的藥理作用。

圖1 EG的藥理作用

1 抗氧化作用

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)作為調(diào)節(jié)生物體生命活動的信號分子,在生命活動中發(fā)揮重要作用。ROS種類繁多,主要包括過氧化氫(H2O2)、次氯酸、羥基自由基(·OH)、過氧亞硝酸鹽(ONOO-)和超氧陰離子自由基(·O2-)。ROS水平的變化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。EG的抗氧化作用使其成為抗氧化失衡相關(guān)疾病的有效化合物。

內(nèi)源性低水平的H2O2可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子,激活多種信號通路[2]。然而,過量的細(xì)胞H2O2會觸發(fā)毒性反應(yīng)過程[3]。在血管組織中,當(dāng)H2O2擴(kuò)散到鄰近的血管平滑肌時,可引起局部肥大現(xiàn)象,嚴(yán)重者可誘發(fā)血管炎癥,最終導(dǎo)致慢性血管疾病。

EG的抗氧化性能使其成為一種良好的H2O2清除劑。有研究表明,在膿毒癥犬中注射EG后,血清中H2O2濃度明顯降低,低血壓癥狀緩解。EG阻止了過氧化氫酶被過氧化氫類似物過氧乙酸轉(zhuǎn)化,從而保護(hù)過氧化氫酶活性。這證明,EG通過清除過量的H2O2,抑制過氧化氫酶(Catalase,CAT)變性,從而發(fā)揮抗氧化作用,調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定,抑制血管功能障礙[4]。

除H2O2外,羥自由基還會損傷體內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子,導(dǎo)致癌癥、動脈粥樣硬化和神經(jīng)變性的患病率增加。EG加入Fenton反應(yīng)體系(Fe3+/H2O2/抗壞血酸)后,可與DNA形成插入式復(fù)合物,保護(hù)DNA大分子免受氧化應(yīng)激損傷,并通過提供氫離子中和羥自由基,發(fā)揮自由基清除機(jī)制,保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)免受氧化損傷[5]。體內(nèi)的過氧化產(chǎn)物,如脂質(zhì)過氧化物,會降低抗凝因子的活性,導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)形成血栓,而EG可降低羥自由基對抗凝血酶Ⅲ活性的氧化損傷,發(fā)揮抗氧化作用抑制血栓形成[6]。

EG在體外能夠清除超氧陰離子自由基、羥基自由基和過氧化氫,表現(xiàn)出抗氧化作用[7]。Sawai等學(xué)者[8]通過核磁共振方法,分析了EG清除DPPH自由基的分子機(jī)制,即作為供電子化合物,在清除DPPH自由基的同時自身被氧化為沒食子酸乙酯自由基(氧化形式),該產(chǎn)物具有非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),難從自由基清除后產(chǎn)生的氧化形式還原,從而可以表現(xiàn)與α-生育酚(抗氧化劑)相當(dāng)?shù)目寡趸芰Α?/p>

氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病和腫瘤中起著至關(guān)重要的作用。EG的抗氧化特性使其成為一種良好的抗氧化應(yīng)激藥物,可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的平衡來緩解相關(guān)疾病的發(fā)展。

Ren等學(xué)者[9]利用H2O2刺激PC-12細(xì)胞建立典型的氧化應(yīng)激神經(jīng)損傷細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)不同劑量EG(10、20、40 μmol/L)干預(yù)PC12細(xì)胞后可增強(qiáng)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力,阻斷核碎裂和DNA凝集,顯著改善細(xì)胞狀態(tài)。通過流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、免疫熒光和western blot等檢測方法證明其減少PC12過度釋放ROS、抑制半胱天冬酶(caspase )9/3活化、破壞DNA修復(fù)酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)和維持線粒體膜電位,調(diào)控凋亡相關(guān)Bax/Bcl-2比值和細(xì)胞色素C(Cytochrome C)釋放,減緩了氧化應(yīng)激。此外,EG還會激活細(xì)胞防御機(jī)制的主要調(diào)節(jié)因子核紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(Nrf2)的核移位,增強(qiáng)其下游靶點(diǎn)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]的表達(dá)和上調(diào)谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,從而在內(nèi)源性途徑中發(fā)揮抗氧化作用。

Chandrasekaran等學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn),EG(10 mg/kg)灌胃治療4-硝基喹啉-1-氧化物(4- NQO)誘導(dǎo)的口腔癌小鼠后,與4-NQO組相比,改善小鼠體重,降低腫瘤負(fù)荷50%,減少異常增殖細(xì)胞50%,未發(fā)生鱗狀上皮細(xì)胞癌,并降低脂質(zhì)過氧化水平。通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)等抗氧化酶的活性,提高還原型谷胱甘肽(GSH)、維生素C(Vitamin C,VC)和維生素E(Vitamin E,VE)等非酶抗氧化劑的釋放水平,可逆轉(zhuǎn)異常增生的腫瘤細(xì)胞為正常上皮結(jié)構(gòu),從而發(fā)揮抗癌作用。

過量的糖攝入會增加葡萄糖代謝的有毒代謝物產(chǎn)生,從而加重內(nèi)源性抗氧化和解毒系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。HoYin Lip等學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)EG干預(yù)大鼠肝細(xì)胞后,通過減少ROS生成和保護(hù)線粒體膜電位發(fā)揮抗氧化作用,保護(hù)肝細(xì)胞免受乙二醛、甲基乙二醛等毒性代謝物引起的氧化損傷。

2 抗炎作用

炎癥反應(yīng)是機(jī)體重要的防御過程,有助于維持機(jī)體的完整性,抵御物理、化學(xué)和病毒的感染性損傷,而過度的炎癥會損害正常的器官和身體狀態(tài)。因此,抑制炎癥反應(yīng)的過度發(fā)生對保護(hù)機(jī)體至關(guān)重要。

2.1 抑制動脈粥樣硬化中的炎癥反應(yīng)

單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附是動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中最早且必不可少的過程之一。這一過程由內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附分子(endothelial-leukocyte adhesion molecules,ELAMs)介導(dǎo),ELAMs表達(dá)于血管內(nèi)皮表面,覆蓋動脈粥樣硬化和炎癥病變。

Murase等學(xué)者[12]檢測了HL-60(一種早幼粒細(xì)胞單核細(xì)胞系)在靜態(tài)條件下與細(xì)胞因子激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的黏附,發(fā)現(xiàn)EG(3 ～ 10 mmol/L)預(yù)處理HUVECs后,可抑制NF-kB p65的核轉(zhuǎn)位,降低白細(xì)胞介素-1α (IL-1α)或腫瘤壞死因子-a (TNF-a)誘導(dǎo)的NF-kB活性進(jìn)而減少血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)和e-選擇素的表達(dá)、降低白細(xì)胞黏附發(fā)揮抗炎特性。

Liu等學(xué)者[13]研究發(fā)現(xiàn),不同劑量的EG腹腔注射于ApoE-/-小鼠后,降低了血清中炎性因子IL-6、TNF-α和趨化因子MCP-1等相關(guān)因子的濃度,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)EG可降低小鼠動脈弓部位的炎性細(xì)胞浸潤情況。在斑馬魚模型中,研究發(fā)現(xiàn)EG可抑制中性粒細(xì)胞的生成與遷移。EG可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。在體外模型細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,EG還能抑制RAW264.7中炎癥因子IL-6和TNF-α發(fā)揮抗炎作用,與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 抑制肺損傷中的炎癥反應(yīng)

炎癥及其伴隨的過度氧化應(yīng)激反應(yīng)與肺損傷(acute lung injury,ALI)的進(jìn)展和結(jié)果密切相關(guān)。Mehla等學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn),不同劑量(1,5和10 mg/kg) EG腹腔注射小鼠可減輕肺泡水腫、出血,以及中性粒細(xì)胞在血管和肺泡區(qū)及其周圍的積累,對小鼠的肺損傷具有保護(hù)作用。

EG可上調(diào)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)損傷小鼠模型中血紅素氧合酶(Hemeoxygenase -1,HO-1)的表達(dá),降低Keap-1水平,增強(qiáng)Nrf2的核內(nèi)聚集,并上調(diào)SOD3的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。此外,單核細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和趨化因子啟動中性粒細(xì)胞內(nèi)流現(xiàn)象,在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。以人單核細(xì)胞系THP-1作為體外模型,模擬LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的炎癥狀態(tài),發(fā)現(xiàn)EG在體外抑制炎癥因子TNF-α,并通過激活Nrf2上調(diào)THP-1中HO-1的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用保護(hù)肺損傷[14]。

Zhang等學(xué)者[15]也發(fā)現(xiàn)以EG為主要活性成分的中藥湯劑對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型具有保護(hù)作用。EG預(yù)處理顯著抑制肺水腫,減輕肺組織學(xué)病變,減少支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的中性粒細(xì)胞、ROS、促炎細(xì)胞因子和白蛋白水平,在體內(nèi)(BALB/c)和體外模型(人單核細(xì)胞)中均減輕ALI中的炎癥狀態(tài)。富含EG提取物顯著減少LPS誘導(dǎo)的肺組織炎性細(xì)胞浸潤。EG預(yù)處理可降低BALF中 W/D比值和蛋白含量,減少BALF中活化的中性粒細(xì)胞浸潤,顯著抑制肺水腫,減輕肺組織學(xué)改變。

2.3 抑制皮膚病中的炎癥反應(yīng)

天然成分也經(jīng)常用于治療炎癥和疼痛相關(guān)疾病,如傷口、關(guān)節(jié)炎癥、炎癥性皮膚病和其他炎癥性疾病[16]。

除上述抗炎作用外,EG也具有其他部位炎癥的抑制作用,比如過敏性疾病和傷口發(fā)炎等。過敏性皮炎的發(fā)展機(jī)制與肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象、組胺釋放水平等密切相關(guān)[17]。Minami等學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn),EG干預(yù)肥大細(xì)胞后,可以顯著抑制C48/80誘導(dǎo)的組胺釋放,抑制率為36.7%±1.33%。這表明EG可以抑制組胺釋放,進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用緩解過敏性疾病。

IL-6在急性炎癥中被誘導(dǎo)生成,并通過促進(jìn)單核細(xì)胞募集觸發(fā)急性炎癥向慢性炎癥的轉(zhuǎn)變。雖然正常水平的促炎細(xì)胞因子可以防止感染并加速傷口的正常愈合,但過度生成細(xì)胞因子是有害的,因?yàn)樗鼤?dǎo)致炎癥和傷口愈合延長[19]。因此,對抗促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生可以介導(dǎo)慢性傷口愈合的治療效果。Toafode等學(xué)者[20]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),用TNF-α刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)作為皮膚炎癥模型來鑒定EG的治療效果,發(fā)現(xiàn)EG可以通過抑制促炎細(xì)胞因子IL-6的釋放來發(fā)揮抗炎作用。

2.4 其他抗炎的相關(guān)研究

炎癥反應(yīng)貫穿在各種疾病發(fā)生發(fā)展中,除了炎性因子IL-1α、IL-6和TNF-α外,NO等炎性介質(zhì)及其相關(guān)酶也對炎癥的發(fā)展發(fā)揮著重要作用。

Wang等學(xué)者[21]研究發(fā)現(xiàn),從分心木提取分離的EG干預(yù)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7后,可抑制巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,發(fā)揮抗炎作用。Park等學(xué)者[22]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),EG干預(yù)RAW 264.7巨噬細(xì)胞后,抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞后NO的釋放水平,顯著減弱LPS誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表達(dá),顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA的積累,提高細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的水平,證明EG可阻斷LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS活性表達(dá)和激活Nrf2/HO-1信號通路從而發(fā)揮抗炎作用。

3 治療代謝性疾病

代謝性疾病在我國的患病率逐年上升,這主要是人們生活水平和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起。此類疾病主要包括糖代謝和脂質(zhì)代謝兩個領(lǐng)域。糖脂代謝性疾病主要包括糖尿病、動脈粥樣硬化、高脂血癥和戈謝病等。目前眾多研究學(xué)者對此類疾病的攻克集中于天然產(chǎn)物方向,并且取得了一定的研究進(jìn)展。

3.1 糖代謝疾病

糖脂代謝性疾病主要以糖脂代謝紊亂為特征,由遺傳因素、環(huán)境因素和生活方式等多種因素參與。Ⅱ型糖尿病(T2D)已成為一種常見的糖代謝疾病。若控制不當(dāng),會增加大血管、微血管及代謝性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn),適當(dāng)?shù)难强刂茖μ悄虿』颊叻浅Ｖ匾?。目前預(yù)防Ⅱ型糖尿病的方法包括抑制α-葡萄糖苷酶、刺激胰島素分泌、增加胰島素敏感性和抑制腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等。

Ahn等學(xué)者[23]發(fā)現(xiàn)EG干預(yù)后3T3-L1細(xì)胞內(nèi)脂滴積聚減少,通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)和增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(CCAAT/enhancer binding proteins α,C/EBPα)的表達(dá)來抑制3T3-L1細(xì)胞內(nèi)早期脂肪形成。解析出EG激活腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase,AMPK)抑制3T3-L1細(xì)胞脂肪生成,刺激葡萄糖攝取,從而發(fā)揮抗糖尿病和抗肥胖作用。此外,通過分子對接研究EG與蛋白酪氨酸磷酸酶非受體6型(Protein tyrosine phosphatase non receptor type-6,PTPN6)和PPARγ的結(jié)合能力,以此佐證了EG的抗糖代謝作用機(jī)制。

降低餐后血糖和隨后胰島素峰值水平是抑制腸道對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的治療途徑之一。Wang等學(xué)者[24]在Caco-2細(xì)胞中用一定劑量的EG進(jìn)行干預(yù)后,可控制餐后腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)水平,使餐后血糖水平降至穩(wěn)定狀態(tài)。

α-葡萄糖苷酶又稱α-d-葡萄糖苷水解酶,是參與機(jī)體葡萄糖代謝過程、影響體內(nèi)血糖濃度的一種重要水解酶。薛琛等學(xué)者[25]通過紫外分光光度法、同步熒光光譜法和分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn),EG ( IC50=2.97 mg·mL-1)通過氫鍵與疏水作用力與α-葡萄糖苷酶自發(fā)結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物,對α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出良好的抑制作用。另外,分子對接顯示EG與α-葡萄糖苷酶的疏水口袋結(jié)合并形成氫鍵,對接能量為-26.48 kJ·mol-1,這佐證了EG對α-葡萄糖苷酶的抑制作用,其具有抗糖代謝的潛力。

3.2 脂質(zhì)代謝疾病

脂質(zhì)代謝疾病中典型的是動脈粥樣硬化,這是一種由炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂引起的慢性疾病。因此,研究和治療脂質(zhì)沉積和炎癥是抑制動脈粥樣硬化早期病變發(fā)展的有效途徑。

Liu等學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)給ApoE-/-小鼠(一種以脂肪條紋為典型特征的早期動脈粥樣硬化病變模型)腹腔注射EG (20 mg/kg)可顯著減少主動脈和主動脈弓內(nèi)脂質(zhì)沉積斑塊面積和炎性細(xì)胞浸潤。血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)濃度升高2倍,且MCP-1、IL-6和TNF-α水平顯著降低。

斑馬魚作為一種新興的疾病動物模型也常用于研究脂質(zhì)代謝紊亂性疾病的研究[26]。一項(xiàng)研究證明,一定劑量EG喂食斑馬魚后,顯著改善了體內(nèi)的血管膽固醇沉積以及中性粒細(xì)胞的生成和遷移[13]。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,EG (20 μmol/L)處理巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞減少泡沫細(xì)胞的數(shù)量,并抑制細(xì)胞內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6、MCP-1和TNF-α的釋放。EG可通過激活脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1(ATP-binding cassette transporter A1)和ABCG1((ATP-binding cassette transporter G1)),促進(jìn)膽固醇外流,減少氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)蓄積,抑制巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)紊亂[13]。

低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的氧化修飾與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。LDL在血管壁的沉積和修飾會導(dǎo)致單核細(xì)胞募集到血管內(nèi)皮下間隙,進(jìn)而分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞大量地吞噬經(jīng)過氧化修飾的LDL顆粒,向泡沫細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變,隨后泡沫細(xì)胞破裂,觸發(fā)動脈粥樣硬化性疾病的惡化。EG抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NF-kB核轉(zhuǎn)運(yùn)和血管內(nèi)皮細(xì)胞中白細(xì)胞黏附分子的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞過量吞噬ox-LDL,緩解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂,具有調(diào)控脂質(zhì)平衡的潛力[27]。

4 其他作用

除上述作用外,EG還有多種生物活性。EG可以調(diào)節(jié)血壓。Lim等學(xué)者[28]發(fā)現(xiàn)EG及其提取物通過抑制Ca2+和Na+內(nèi)流進(jìn)入腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞,激活iNOS增加NO生成來介導(dǎo)Ca2+攝取減少進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)Ca2+儲存,從而抑制乙酰膽堿誘發(fā)的兒茶酚胺類激素分泌,發(fā)揮有益的抗高血壓活性。

EG具有抗過敏和鎮(zhèn)痛作用。組胺是觸發(fā)過敏反應(yīng)的重要介質(zhì),抑制其在細(xì)胞內(nèi)的分泌可起到抑制過敏的作用。 Minami等學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn),EG抑制化合物C48/80誘導(dǎo)的大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺釋放。此外,EG以劑量依賴性通過調(diào)控K+通道的激活和Gi/o蛋白的痛覺敏感機(jī)制,在小鼠和大鼠的不同化學(xué)、機(jī)械和熱傷害性感受模型中發(fā)揮抗痛覺過敏、抗傷害性感受作用[29]。

5 小結(jié)與展望

EG是一種存在于多種藥用植物和天然食物中的代謝產(chǎn)物,如余甘子、葡萄酒和白芍等。近年來,EG在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用呈上升趨勢。雖然EG的抗炎、抗癌和抗菌作用已被研究,但具體作用機(jī)制尚未明確。在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面,多數(shù)研究為理論和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),缺少動物模型等,仍需進(jìn)一步研究。這一不足之處也是后期重點(diǎn)研究的潛在方向。另外,EG作為一種多酚類化合物,雖然具有廣泛的生物活性,但具有易氧化的缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。如果對其進(jìn)行大分子包封和修飾或?qū)U(kuò)大研究范圍,加速其開發(fā)與應(yīng)用。EG的研究和利用越深入,對EG的認(rèn)識就越全面,這將為今后的科學(xué)制藥和臨床用藥提供重要依據(jù)。