柴莎莎,徐圣

(武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,湖北 武漢 430074)

荷葉,又稱蓮徑或者蓮花徑,是睡蓮科蓮屬多年生草本挺水植物蓮荷的葉[1]。2015版《中國藥典》記載,荷葉性平,味苦,歸肝、脾、胃經(jīng),具有清暑化濕、涼血止血等功效,主要用于暑熱煩渴,脾虛泄瀉等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,荷葉還具有明顯的降血脂、降血壓、平衡膽固醇等生理活性[3]。在食用方面,人們將荷葉入茶達(dá)到滋補(bǔ)養(yǎng)生的目的,有些菜肴的制作也用到了荷葉[4]。

我國荷葉資源豐富,荷葉價格低,易獲取,作為天然藥用植物資源有很大的潛力。但是目前荷葉利用率很低,僅有極小部分用于臨床治療或加工成保健食品。荷葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展與精準(zhǔn)扶貧相結(jié)合,具有巨大生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。在中華人民共和國衛(wèi)生部衛(wèi)監(jiān)發(fā)布的(1991)第45號文件中,荷葉在第二批藥食同源的名單中[5],這為荷葉產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)鏈拓展到藥品、食品領(lǐng)域提供了政策支撐。

在荷葉眾多的化學(xué)成分中,生物堿是荷葉主要有效成分之一[6],具有抑制膽固醇生產(chǎn)、降血脂、抗菌和抗氧化等活性[7],因此,可將其應(yīng)用于醫(yī)療或保健食品中,有很大的市場潛力。荷葉堿在荷葉中含量較多,是荷葉中的特征生物堿,成為近年來研究的熱點(diǎn)。

本研究以荷葉為原料,利用超聲波法提取荷葉堿,利用單因素實(shí)驗(yàn)法對不同提取條件對荷葉堿提取率的影響進(jìn)行了研究,設(shè)計正交試驗(yàn)優(yōu)化荷葉中荷葉堿的提取條件,旨在獲得最佳的提取條件。旨在為今后荷葉食品的開發(fā)、加工應(yīng)用及質(zhì)量控制提供物質(zhì)基礎(chǔ)研究,對荷葉食品化工產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品,純度98%,成都普思生物科技股份有限公司;乙腈,色譜純,上海業(yè)坦化工科技有限公司;甲醇,色譜純,上海業(yè)坦化工科技有限公司;三乙胺,色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;冰乙酸,分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;荷葉,采摘于湖北武漢、洪湖、隨州、鄂州地區(qū),粉碎干燥后,常溫密封備用。

1.2 分析測試儀器

高效液相色譜儀,1260型,美國安捷倫有限公司;電子微量天平,XS205DU型,METTLER TOLEDO有限公司;超聲波清洗機(jī),SB-800D型,寧波新芝有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,RE- 501EX型,鄭州凱瑞儀器設(shè)備有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,HD-E804-55,武漢海達(dá)國際儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜條件

檢測器:DAD;色譜柱:ZORBAX C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:A-乙腈;B-水溶液(2%三乙胺+1%冰乙酸)體積比=50∶50;時間:18 min;流速:0.8 mL/min ;檢測波長:270 nm;柱溫:30 ℃進(jìn)樣量:5 μL。

1.3.2 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,加甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中。

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,使用甲醇溶液定容,進(jìn)液相進(jìn)行測定。以荷葉堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)峰的峰面積為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 試樣溶液的測定

將荷葉堿提取后,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對荷葉堿提取液進(jìn)行濃縮,放入干燥箱中進(jìn)行干燥,精密稱取干燥后的荷葉堿,記錄重量。將荷葉堿置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,過0.25 μm有機(jī)濾膜,注入液相色譜中,進(jìn)行測定,記錄荷葉堿特征峰面積,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算荷葉堿含量。

1.3.4 荷葉堿提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 提取方式優(yōu)化

考察索氏抽提法、冷凝回流法和超聲提取法對提取荷葉堿含量的影響,使用相同的提取條件:80%乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶20(g∶mL),將同一批荷葉提取后的荷葉堿樣品定容至100 mL容量瓶中,按1.3.1的方法測定提取液中荷葉堿的含量。

1.3.4.2 提取條件優(yōu)化

將乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%,50%,75%,85%,100%)、提取時間(30,60,90,120,150 min)、提取溫度(40,50,60,70,80 ℃)、料液比(1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30(g∶mL))、超聲功率(40,50,60,70,80 W)作為單因素實(shí)驗(yàn),探究其對荷葉堿得率的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對荷葉堿提取率影響較大的因素做正交試驗(yàn),優(yōu)化提取條件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方式

采用80%乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶20(g∶mL),超聲功率60 W的相同提取條件下,使用超聲提取的方式荷葉堿得率最高,其次為索氏抽提法,冷凝回流法荷葉堿得率最低。選用超聲提取作為提取荷葉堿的方式。

2.1.2 乙醇濃度

由圖1可知,荷葉堿提取率受乙醇濃度的影響較大,荷葉堿提取率隨著乙醇濃度的增加,荷葉堿的提取率也隨之上升,乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時荷葉堿提取率達(dá)到最大值,此后乙醇濃度增加了,反而荷葉堿的提取率下降了,這可能是由于荷葉堿在75%乙醇體積分?jǐn)?shù)時溶解度最大,因此選用75%乙醇體積分?jǐn)?shù)作為荷葉堿的提取條件。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的比較

2.1.3 提取時間

由圖2可知,荷葉堿提取率隨著提取時間的增長呈上升的趨勢,到60 min達(dá)到最大,超過60 min后,開始下降,同時考慮到長時間較高溫度條件下提取可能會使荷葉堿變質(zhì)分解,因此從節(jié)省能源同時保證荷葉堿較高提取量的角度出發(fā),選取60 min作為荷葉堿的提取條件。

圖2 提取時間的比較

2.1.4 提取溫度

由圖3可知,荷葉堿提取率隨著提取溫度的升高呈上升的趨勢,當(dāng)溫度上升到70 ℃后,荷葉堿提取率上升緩慢,當(dāng)溫度高于80 ℃(乙醇的沸點(diǎn)為78 ℃)將有乙醇蒸發(fā),穩(wěn)定再升高對荷葉堿的提取率影響較小,因此選取溫度70 ℃作為荷葉堿的提取條件。

圖3 提取溫度的比較

2.1.5 料液比

由圖4可知,荷葉堿提取率隨著料液比的增加呈上升的趨勢,當(dāng)料液比為1∶20(g∶mL)時,荷葉堿的提取率最高,因此選取料液比為1∶20(g∶mL)作為荷葉堿的提取條件。

圖4 料液比的比較

2.2 荷葉堿提取條件的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對荷葉堿提取率影響較大的四個因素即乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比做正交試驗(yàn),每個因素選取三個水平。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。根據(jù)設(shè)計的因素水平表進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),其結(jié)果見表2。

表1 荷葉堿提取條件正交試驗(yàn)因素水平表

由表2可知,四個因素對荷葉堿得率的影響大小為:A>B>D>C即乙醇濃度>提取時間>料液比>提取溫度。通過正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件為A1B2C3D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,提取時間60 min,提取溫度70 ℃,料液比20 mL/g。

按照得到的最佳提取條件提取荷葉中的荷葉堿,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到荷葉堿的得率為0.059 7%,這說明正交試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

表2 荷葉堿提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 湖北不同地區(qū)荷葉中荷葉堿含量測定結(jié)果

使用正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件對湖北不同地區(qū)10批荷葉進(jìn)行提取,提取后按照1.3.1～1.3.3的方法測定荷葉堿的含量,結(jié)果見表3。

表3 不同地區(qū)荷葉中荷葉堿含量

由表3結(jié)果可知,不同產(chǎn)地的荷葉堿含量差別很大,其中湖北武漢的荷葉樣品中荷葉堿含量最高,其次為洪湖地區(qū)的荷葉樣品。

3 結(jié)論

超聲提取方法是一種快速提取荷葉中荷葉堿的優(yōu)良方法,本研究以荷葉為原料,用超聲輔助提取荷葉堿,使用液相方法檢測荷葉堿得率,采用單因素試驗(yàn)探究不同提取條件對荷葉堿得率的影響,通過正交試驗(yàn)確定了荷葉堿的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,提取時間60 min,提取溫度70 ℃,料液比1∶20(g∶mL)。使用優(yōu)化好的提取條件提取并測定了10批湖北不同地區(qū)的荷葉樣品中荷葉堿的含量,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的荷葉堿含量差別很大。但是樣品量較小,不能代表整個地區(qū)的荷葉水平,后期可用此最佳提取條件測定更多批次的荷葉中的荷葉堿,為荷葉藥材質(zhì)量控制及其在保健食品中的開發(fā)提供參考。