周志強(qiáng)，劉桂鳳，洪挺，許妍，肖小武

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

婦康寶口服液非國家基本藥物，為一類非處方藥。處方由熟地黃、白芍、當(dāng)歸、阿膠、川芎、艾葉、甘草等七味中藥組成，其功效主要是補(bǔ)血止血，臨床一般用于治療失血過多，面色萎黃，月經(jīng)不調(diào)，小腹冷痛等癥狀［1-4］。該處方中阿膠具有補(bǔ)血滋陰、安胎止血的功效，艾葉能夠溫經(jīng)止血，安胎止痛，兩者共為君藥；當(dāng)歸、川芎、白芍及熟地黃四味藥，具有養(yǎng)血和血、調(diào)補(bǔ)沖任的作用，共為臣佐藥；甘草可以健脾和中，配合白芍緩急止痛，合阿膠善于止血，可以調(diào)和諸藥，作為使藥。

其制法為先提取當(dāng)歸、川芎和艾葉三者的揮發(fā)油，剩下的藥渣跟熟地黃、白芍、甘草混合，加適量水煎煮，濾過，濾液濃縮；另取紅糖404 g 或蔗糖400 g 制成糖漿，阿膠用水加熱溶化，一并混入上述濾液中，攪拌均勻，放冷后加入上述揮發(fā)油與適量水，制得［5］。從處方所含藥味可知，婦康寶口服液中主要含有苯丙素類、萜類及三萜皂苷等成分，其化學(xué)成分豐富且復(fù)雜。

指紋圖譜是采用色譜法、光譜法等分析方法得到的能體現(xiàn)中藥整體特征的圖譜，將圖譜某些重要特征信息或整體信息用于中藥質(zhì)量整體控制和評(píng)價(jià)，可科學(xué)、系統(tǒng)地體現(xiàn)制劑的整體性和復(fù)雜性，能較全面地展示中藥材及制劑所含化學(xué)成分的相對(duì)關(guān)系，具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)［6-8］。

目前有關(guān)婦康寶口服液的文獻(xiàn)報(bào)道主要圍繞鑒別、檢查、含量測(cè)定及臨床應(yīng)用［9-15］，而其指紋圖譜方面的相關(guān)研究未見報(bào)道。為真實(shí)反映婦康寶口服液整體特性，科學(xué)評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性、均一性及不同廠家產(chǎn)品的差異，本研究采用高效液相色譜法對(duì)婦康寶口服液進(jìn)行指紋圖譜研究，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000 戴安高效液相色譜儀（Chromeleon 7 色譜工作站）；賽多利斯 BSA 124S-CW 電子天平，賽多利斯BT25S 電子天平，KQ-500E 型超聲波儀（昆山超聲儀器有限公司）。

甲醇和乙腈為色譜純；磷酸和乙醇為分析純；水為Milli-Q 超純水儀制備的純化水。沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201906，含量：91.5%），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-202119，含量：96.3%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202145，含量：94.6%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201915，含量：99.4%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-202209，含量：95.2%），苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：100419-201302，含量：100.0%），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-202122，含量：94.4%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：AF20030804，含量：98.0%），隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：AF20032707，含量：98.0%），均購自成都埃法生物科技有限公司。芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（批 號(hào)：CFN99774，含 量：98.0%），1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：CFN90192，含量：98.0%），均購自上海洽姆儀器科技有限公司。婦康寶口服液樣品來源于5 個(gè)企業(yè)，分別為A 企業(yè)（S1：批號(hào)20190306，S2：批號(hào)20190307，S3：批號(hào)20190308，S4：批 號(hào)S2020080501，S5：批 號(hào)20200428）、B 企 業(yè)（S6：批 號(hào)201206，S7：批號(hào)201207，S8：批號(hào)201208）、C 企業(yè)（S9：批號(hào)160401）、D 企業(yè)（S10：批號(hào)190201）、E 企業(yè)（S11：批號(hào)43210101）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 精密量取樣品2 mL，置10 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液的制備 取芍藥苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加適量甲醇使溶解并稀釋成每1 mL 中含芍藥苷0.15 mg 和甘草酸銨0.07 mg 的混合溶液，搖勻，即得。取熟地黃、白芍等七種藥材適量，按處方工藝制備，再按“2.1.1”項(xiàng)下制備方法，分別制成各對(duì)照藥材的溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 C18-AR（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，檢測(cè)波長為250 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.3 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積。以9 號(hào)色譜峰（芍藥苷）的保留時(shí)間及峰面積為參照，計(jì)算供試品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.4%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取婦康寶口服液（批號(hào)：20200428）6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下處理方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰保留時(shí)間和峰面積。以9 號(hào)色譜峰（芍藥苷）的保留時(shí)間及峰面積為參照，計(jì)算供試品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.3%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.9%，表明測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣分析，記錄所有共有峰的保留時(shí)間和峰面積。以9 號(hào)色譜峰（芍藥苷）的保留時(shí)間及峰面積為參照，計(jì)算供試品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 對(duì)照指紋圖譜的建立

取11 批婦康寶口服液樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析，得到11 批樣品的色譜圖。將11 批樣品的圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 年版中，得到HPLC 疊加指紋圖譜，見圖1。經(jīng)過多點(diǎn)校正及峰匹配，最終生成婦康寶口服液的對(duì)照指紋圖譜，確定19 個(gè)共有峰，見圖2。

圖1 11批婦康寶口服液疊加指紋圖譜

圖2 婦康寶口服液對(duì)照指紋圖譜

2.7 共有峰的標(biāo)定與指認(rèn)

分別取“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照藥材溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。對(duì)色譜峰的保留時(shí)間和光譜圖進(jìn)行確認(rèn)，得出1、8、9、12 號(hào)峰歸屬白芍；2 號(hào)峰歸屬熟地黃、阿膠；3 號(hào)峰歸屬當(dāng)歸、川芎、熟地黃；4、6、7 號(hào)峰歸屬當(dāng)歸、川芎、艾葉；5、11、14～19 號(hào)峰歸屬甘草；10 號(hào)峰歸屬當(dāng)歸、川芎；13 號(hào)峰歸屬艾葉。再通過與相應(yīng)對(duì)照品溶液的保留時(shí)間及光譜圖比對(duì)，指認(rèn)了其中11 個(gè)色譜峰，峰1為沒食子酸、峰4 為新綠原酸、峰6 為綠原酸、峰7 為隱綠原酸、峰8 為芍藥內(nèi)酯苷、峰9 為芍藥苷、峰10 為阿魏酸、峰11 為甘草苷、峰12 為苯甲酸、峰13 為1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖、峰18 為甘草酸。由于9 號(hào)峰芍藥苷為白芍的專屬峰，其峰面積大小適中，與前后色譜峰分離度較好，而且保留時(shí)間居中，故選擇其作為參照峰（S）。

2.8 相似度計(jì)算

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012年版對(duì)11 批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，11 批樣品相似度分別為0.970，0.971，0.976，0.861，0.979，0.974，0.979，0.975，0.774，0.838，0.962。

3 討論

由于婦康寶口服液處方中成分的復(fù)雜性和多樣性，各個(gè)化學(xué)成分的紫外吸收波長不同。沒食子酸的最大吸收波長為（272±2）nm、綠原酸的最大吸收波長為（252±2）nm、芍藥內(nèi)酯苷的最大吸收波長為（233±2）nm、芍藥苷的最大吸收波長為（233±2）nm、阿魏酸的最大吸收波長為（245±2）nm、甘草苷的最大吸收波長為（270±2）nm、甘草酸銨的最大吸收波長為（254±2）nm，為兼顧各成分的紫外吸收，最終選擇250 nm 為檢測(cè)波長。

對(duì)比不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液）以及不同的洗脫程序?qū)ιV峰分離的影響，結(jié)果當(dāng)流動(dòng)相系統(tǒng)采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫時(shí)，各色譜峰的分離效果最佳，各色譜峰峰形較好。

實(shí)驗(yàn)中考察了不同提取方式（稀釋、超聲、萃取、回流），結(jié)果直接稀釋與超聲兩種方法處理的供試品中色譜峰信息較全面、峰面積較大，且直接稀釋法相對(duì)超聲方式更為簡便快捷，故選擇直接稀釋法為供試品前處理方法。

通過對(duì)11 批婦康寶口服液樣品測(cè)定，A、B、E 三個(gè)企業(yè)樣品的相似度均大于0.85，而C 企業(yè)樣品相似度（0.774）與D 企業(yè)樣品相似度（0.838）則偏小，原因在于這兩個(gè)企業(yè)樣品的共有峰峰面積相對(duì)較小，很可能是生產(chǎn)時(shí)投料不足或所投藥料質(zhì)量較差導(dǎo)致，提示這兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加以改進(jìn)，提升藥品質(zhì)量。

本研究通過比較對(duì)照品和對(duì)照藥材中主峰保留時(shí)間和紫外吸收光譜，對(duì)婦康寶口服液中主要特征峰進(jìn)行了歸屬，建立了成品的液相指紋圖譜，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，為有效控制婦康寶口服液的質(zhì)量并進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)提供了可靠方法。