吳共發(fā) 邱麗湞 曾宇婷 劉鈺君 賴劍龍 姚金科

廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 1 病理科,2 健康管理中心,3 肝膽外科,廣東廣州市 511300

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,近年來,隨著人們飲食習慣和社會環(huán)境的不斷變化,其發(fā)病率逐年增高,目前已經(jīng)成為全世界死亡率第二的腫瘤,嚴重威脅人們的身體健康和生命安全[1]。其中,CRC遠處轉(zhuǎn)移是導致患者預后差和死亡率高的主要原因,也是影響CRC 5年生存率的最強獨立預后因素之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3],腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophil, TAN)是CRC的獨立危險因素。既往研究證實[4-6],上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可通過特定程序?qū)⑸掀ぜ毎D(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細胞,上皮鈣黏素(E-cadherin)表達減弱甚至缺失和波形蛋白(vimentin)表達增加是判斷是否發(fā)生EMT的金標準。EMT與CRC的侵襲、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有緊密聯(lián)系,可以作為新的治療策略和途徑。因此,本研究對TAN和EMT在CRC中的臨床病理意義進行探討,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析本院2013年9月至2015年12月期間經(jīng)結(jié)直腸癌手術治療的100例患者的病歷,收集患者的癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織5cm以上的正常腸黏膜組織)。納入標準:(1)所有患者均經(jīng)過病理證實為腺癌;(2)患者術前均未進行放化療和靶向治療。排除標準:(1)有其他惡性腫瘤病史;(2)合并其他肝腎疾病、心腦血管疾病者;(3)不能配合者。納入研究的患者中,男性57例,女性43例;年齡20～91(62.41±12.65)歲;TNM分期[7]:Ⅰ期22例,Ⅱ期34例,Ⅲ～Ⅳ期44例;分化程度:低分化10例,中分化78例,高分化12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例;生存隨訪從術后的第一天開始,本研究的觀察終點時間為2021年6月4日或該終點時間點之前因任何原因死亡,平均生存期為(57.26±26.25)個月。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核并批準。

1.2 方法

1.2.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色檢測TAN浸潤情況 所有病理標本經(jīng)過4%中性緩沖甲醛進行固定,經(jīng)全自動組織脫水機進行固定、脫水、透明和浸蠟,自動包埋機進行石蠟包埋制作成石蠟組織塊,4.0 μm厚切片,全自動染色機進行常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,由高級職稱病理醫(yī)師使用顯微鏡進行觀察。觀察病變范圍及程度、黏膜上皮是否完整、腺體排列是否規(guī)則、隱窩結(jié)構(gòu)是否正常、炎癥細胞浸潤是否增多,以及腺上皮細胞是否有變化。

1.2.2 免疫組化檢測結(jié)果判定 即用型E-cadherin抗體(貨號MAB-0738)和vimentin抗體(貨號MAB-0735)均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司,免疫組化檢測試劑盒(貨號GK500710)購自丹麥Dako公司。免疫組化檢測操作嚴格按照試劑盒說明進行。E-cadherin陽性對照為闌尾腺上皮組織、陰性對照為闌尾平滑肌組織,vimentin陽性對照為闌尾間質(zhì)組織、陰性對照為闌尾腺上皮組織。免疫組化染色完成后,由2名病理醫(yī)師盲法判讀。判斷標準[8]:觀察高倍(400×)視野下陽性細胞數(shù)及染色強度。隨機選取5個高倍視野,計數(shù)至少200個細胞。細胞未染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分?？傇u分=不同染色狀態(tài)的細胞數(shù)×對應的染色評分。將E-cadherin評分<200分稱為表達下降,vimentin評分>30分稱為表達上調(diào)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(x±s)表示,組間的比較采用t檢驗和t′檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)和百分數(shù)表示,比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier分析進行生存分析,采用Spearman相關性分析進行TAN和EMT與CRC的相關性分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC患者癌組織和癌旁正常組織TAN浸潤情況 在100例CRC患者中,29例CRC組織中有TAN浸潤,癌旁正常組織的腺體底部均未見中性粒細胞,見圖1。

A:癌旁正常組織無TAN浸潤;B:CRC組織有TAN浸潤(×400)

2.2 不同TAN浸潤情況CRC患者臨床資料的比較 在CRC患者中,有TAN浸潤者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況較無TAN浸潤者差,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表1。

表1 不同TAN浸潤情況CRC患者臨床資料的比較

2.3 不同TAN浸潤情況CRC患者的生存情況的比較 共100例患者,經(jīng)過隨訪后刪失8例。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),有TAN浸潤患者的中位生存時間為28個月,無TAN浸潤患者的累積生存率高于有TAN浸潤患者,差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=46.436,P<0.001),見圖2。

圖2 不同TAN浸潤情況CRC患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 CRC組織和癌旁正常組織E-cadherin和vimentin的表達情況的比較 在CRC患者中,E-cadherin免疫組化染色總評分低于癌旁正常組織,vimentin免疫組化染色總評分高于癌旁正常組織(均P<0.05),見圖3、表2。

表2 CRC組織和癌旁正常組織E-cadherin和vimentin的表達情況的比較 [n(%),分]

A:E-cadherin在癌旁正常組織中陽性表達;B:E-cadherin在CRC組織表達明顯減弱;C:Vimentin在癌旁正常組織中陰性表達;D:Vimentin在CRC組織中陽性表達(×400)

2.5 CRC患者EMT標志物與TAN浸潤的相關性分析 Spearman相關性分析結(jié)果顯示,TAN浸潤與E-cadherin表達呈負相關(rs=-0.498,P<0.001),與vimentin表達呈正相關(rs=0.611,P<0.001),見表3。

表3 CRC患者EMT標志物與TAN浸潤的相關性分析 [n(%)]

3 討 論

中性粒細胞是保護機體免受微生物感染并消除病原體的主要免疫細胞,具有促進腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10-11],TAN可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,且可通過作用于不同細胞因子產(chǎn)生不同分化表型,如分化成具有對抗腫瘤作用的N1表型和具有促生腫瘤作用的N2表型。盡管兩種分型的功能差異較大,但目前尚未有明確的表面標志物能夠?qū)1和N2表型促成的TAN進行有效的區(qū)分。研究顯示[12-13],N1表型的TAN可以通過生成腫瘤壞死因子-α、活性氧類、細胞間黏附分子1、死亡受體等,減少精氨酸酶表達,增強細胞毒性,起到抗腫瘤的作用;而N2表型的TAN則通過表達精氨酸酶、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9等多種趨化因子,促進腫瘤的生長和擴散。TAN作為一種重要的炎癥細胞,在腫瘤微環(huán)境下,可通過生產(chǎn)釋放活性氧類、分泌促腫瘤細胞因子和趨化因子,以及免疫抑制等促進腫瘤發(fā)生,影響腫瘤患者的生存情況[14]。本研究發(fā)現(xiàn),不同TAN浸潤情況CRC患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和生存情況存在差異。這可能是因為腫瘤分期越嚴重、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況越多,治療難度越大,CRC患者生存情況越差。尹小平[15]等報告CRC患者外周血中TAN表達水平高,TAN或具有促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,在組織學層面水平進一步驗證了TAN在CRC中的作用。

腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移首先需要打破與周圍細胞之間的連接,通過破壞基底膜障礙,侵入周圍間質(zhì),從而進入血液循環(huán),造成癌細胞的擴散。EMT是癌細胞在機體內(nèi)發(fā)生侵襲和遷移的重要機制,E-cadherin表達水平下降和vimentin表達水平增加是判斷EMT發(fā)生的重要標志[16]。本研究結(jié)果顯示,和癌旁正常組織比較,CRC組織中E-cadherin表達下降,vimentin表達上調(diào),說明CRC組織中存在EMT現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn),TAN與EMT相關蛋白表達存在密切關系。Berry等[17]的研究發(fā)現(xiàn),高水平的TAN與CRC患者的總體生存改善有關,這可能是因為高水平的TAN能夠抑制腫瘤的分化。研究顯示[18-20],TAN可促進CRC侵襲、轉(zhuǎn)移,造成患者的預后不良,提示TAN可促進EMT的發(fā)生與發(fā)展,進而誘發(fā)了CRC的侵襲、轉(zhuǎn)移,且CRC的發(fā)展部分可能是TAN通過參與EMT過程實現(xiàn)的。

綜上所述,TAN浸潤與E-cadherin表達呈負相關,與vimentin表達呈正相關;TAN可能通過參與EMT過程,促進CRC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。