劉 朝，李小琴，陳 姣，王 凱，張永福

(昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

我國(guó)作為葡萄屬(VitisL.)植物的起源地之一，境內(nèi)葡萄屬植物種類占全世界的60%左右，是世界上葡萄屬植物種類最豐富的國(guó)家之一[1].葡萄(VitisviniferaL.)作為世界五大果樹之一，更是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)果樹植物.自2012年，中國(guó)葡萄總產(chǎn)量就位居世界首位，在2018年約占全世界葡萄總產(chǎn)量的15.04%[2].目前，除澳門外，葡萄在我國(guó)各地均有種植，其中最具代表的是新疆、河北、山東、陜西、云南等地[2].葡萄作為一種冬季落葉果樹，冬季休眠是其生長(zhǎng)過(guò)程中的自然現(xiàn)象，在休眠期間低溫積累量是影響葡萄冬芽萌發(fā)，從休眠狀態(tài)進(jìn)行到生長(zhǎng)階段的重要因素.隨著葡萄栽培面積的擴(kuò)大，南方地區(qū)已成為重要產(chǎn)區(qū)，但由于南方地區(qū)葡萄易在冬季低溫積累量不足，使其冬芽不能完成自然休眠，從而導(dǎo)致休眠期延長(zhǎng)、萌芽不整齊也不完全、葡萄營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)盛、葡萄晚熟、產(chǎn)量下降等問(wèn)題[3，4].利用化學(xué)試劑處理的方法打破葡萄冬芽休眠，提早萌芽，并保持萌芽一致性，進(jìn)而提高葡萄的產(chǎn)量及品質(zhì)，已經(jīng)成為各地葡萄栽培過(guò)程中的重要環(huán)節(jié).

目前，硝酸銨(NH4NO3)、二氯乙醇(C2H5ClO)、單氰胺(H2CN2)、石灰氮(CaCN2)等破眠劑被廣泛應(yīng)用于葡萄冬芽破除休眠，其中以單氰胺效果最好且無(wú)殘留[5-8]，并且單氰胺處理葡萄冬芽后對(duì)果實(shí)的還原性糖、可滴定酸、可溶性固形物及維生素C含量[8-11]影響不顯著.單氰胺可引起植物的過(guò)氧化物酶(POD)活性上升，進(jìn)而可一定程度上提高POD和氧自由基等引起的氧化過(guò)程，使植物呼吸作用向戊糖磷酸途徑轉(zhuǎn)化，提高組織新陳代新的活力，打破植物休眠[8].并且，在葡萄冬芽打破休眠的過(guò)程中，淀粉、可溶性糖和蛋白等含量、POD和超氧化物歧化酶(SOD)活性均會(huì)發(fā)生增加或降低的變化[3]，從而打破葡萄冬芽休眠，提前冬芽萌芽，提高萌芽率，并最終使葡萄果實(shí)提前1～3周成熟[12]，提高經(jīng)濟(jì)效益[5].

‘水晶’葡萄(Vitisvinifera×V.labrusca‘Shuijing’)為歐美雜交種，目前在云南、山東、貴州等地被廣泛種植[13，14]，但目前并未見關(guān)于單氰胺打破‘水晶’葡萄冬芽休眠的生理機(jī)制相關(guān)研究報(bào)道.因此本試驗(yàn)以‘水晶’葡萄為材料，探討單氰胺打破葡萄冬芽休眠的生理響應(yīng)，旨在為葡萄產(chǎn)業(yè)化栽培過(guò)程中打破葡萄冬芽休眠技術(shù)提供理論和技術(shù)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的‘水晶’葡萄枝條采集于云南省紅河州彌勒市東風(fēng)韻葡萄種植基地，為2021年12月中旬冬剪時(shí)，收集修剪下來(lái)的一年生木質(zhì)化枝條，單氰胺(純度為95%)購(gòu)自安徽優(yōu)雅化工有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選生長(zhǎng)狀況一致的葡萄枝條，頂端剪成平口，而下端剪成斜口，每個(gè)枝條留3個(gè)冬芽.將剪好的葡萄枝條分為10組，每組10枝(共約30個(gè)冬芽)，其中5組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%單氰胺溶液均勻涂抹芽和枝條，另外5組涂抹蒸餾水作為對(duì)照，然后將枝條扦插到蒸餾水中，放入恒溫箱在 25 ℃ 環(huán)境下光照 16 h，22 ℃ 環(huán)境下黑暗 8 h 進(jìn)行培養(yǎng).扦插后每隔 7 d 取樣一次，共取6次(第0，7，14，21，28，35 d)，進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定，同時(shí)統(tǒng)計(jì)葡萄枝條的發(fā)芽率和平均芽長(zhǎng)度.

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

取葡萄枝條冬芽采用氮藍(lán)四唑光氧化法、愈創(chuàng)木酚-過(guò)氧化氫顯色法分別進(jìn)行SOD[15]和POD活性[16]的測(cè)定；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色、茚三酮顯色法、蒽酮比色法和苯酚-硫酸法分別進(jìn)行蛋白質(zhì)含量[17]、游離氨基酸[18]、可溶性糖[19]和淀粉[20]含量的測(cè)定；采用納氏定氮法、鉬藍(lán)顯色法和四苯硼鈉法分別進(jìn)行氮、磷、鉀[21]含量的測(cè)定.

總碳含量和碳氮比計(jì)算方法如下：

總碳含量=可溶性糖含量×0.42+淀粉含量×0.44;碳氮比(C·N-1)=碳含量/氮含量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007與SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄枝條發(fā)芽情況觀察和統(tǒng)計(jì)

據(jù)觀察在第 0 d 全部葡萄枝條冬芽均處于休眠狀態(tài)，無(wú)萌芽；第 35 d，單氰胺溶液處理(以下簡(jiǎn)稱：試驗(yàn)組)的葡萄枝條與對(duì)照組相比，冬芽發(fā)芽情況和芽長(zhǎng)勢(shì)更好，且差異顯著(圖1).試驗(yàn)組葡萄的冬芽在第 7 d 開始萌芽，而對(duì)照組在第 21 d 才開始萌芽，明顯晚于試驗(yàn)組 14 d.試驗(yàn)組葡萄第 35 d 的萌芽率達(dá)到93.6%，為對(duì)照組(萌芽率：43.6%)的2.1倍(圖2).此外，試驗(yàn)組葡萄第 35 d 的冬芽平均芽長(zhǎng)度為 6.8 cm，為對(duì)照組(冬芽平均芽長(zhǎng)度：3.5 cm)的1.9倍(圖3).上述結(jié)果說(shuō)明單氰胺確實(shí)可以促進(jìn)葡萄冬芽萌芽、提高萌芽率并促進(jìn)冬芽生長(zhǎng).

蒸餾水 單氰胺 蒸餾水 單氰胺 (a)第0 d (b)第35 d圖1 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理后葡萄的發(fā)芽情況對(duì)比

圖2 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄的發(fā)芽率對(duì)比注：同一處理，不同時(shí)段數(shù)據(jù)上不同小寫字母表示差異 顯著(P<0.05)；不同處理，同一時(shí)段數(shù)據(jù)上不同 大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

圖3 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡萄的 冬芽平均芽長(zhǎng)度對(duì)比

2.2 單氰胺處理對(duì)葡萄冬芽SOD和POD活性影響

對(duì)照組和試驗(yàn)組葡萄冬芽的SOD活性均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)且變化顯著.與第 0 d 相比，第 35 d 試驗(yàn)組‘水晶’葡萄冬芽SOD活性增強(qiáng)了51.96%，而對(duì)照組SOD活性增強(qiáng)了33.42%.而在整個(gè)時(shí)間段，試驗(yàn)組的‘水晶’葡萄冬芽SOD活性始終高于對(duì)照組，第 35 d 試驗(yàn)組葡萄冬芽SOD活性比對(duì)照組高出13.70%(圖4).兩組葡萄的POD活性也均隨時(shí)間總體呈上升趨勢(shì)且變化顯著，與第 0 d 相比，在第 35 d 試驗(yàn)組葡萄冬芽的POD活性增強(qiáng)了 1 904.76%，而對(duì)照組葡萄的POD活性增強(qiáng)了733.33%.同樣的，在整個(gè)時(shí)間段中，試驗(yàn)組葡萄冬芽的POD活性始終高于對(duì)照組，第 35 d 試驗(yàn)組葡萄冬芽的POD活性比對(duì)照組高出140.57%(圖5).上述結(jié)果說(shuō)明單氰胺溶液處理可以提高葡萄冬芽機(jī)體內(nèi)的SOD和POD活性，增加葡萄冬芽的抗氧化能力，有利于冬芽的生長(zhǎng)萌發(fā).

圖4 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡 萄冬芽的SOD活性對(duì)比

圖5 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡 萄冬芽的POD活性對(duì)比

2.3 單氰胺處理后葡萄冬芽氮、磷、鉀含量變化

試驗(yàn)組葡萄冬芽的氮含量先下降后上升，且差異顯著.在第 21 d，其氮含量達(dá)到最低值，隨后不斷上升.而對(duì)照組的氮含量則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì).在第21，28，35 d，試驗(yàn)組葡萄冬芽的氮含量較對(duì)照組分別增加了17.47%，85.52%和212.41%，說(shuō)明單氰胺溶液處理可促使葡萄枝條中氮向冬芽轉(zhuǎn)移，促進(jìn)冬芽萌發(fā)生長(zhǎng)(圖6).試驗(yàn)組葡萄冬芽的磷含量隨時(shí)間均呈下降趨勢(shì).在整個(gè)時(shí)間段中，試驗(yàn)組葡萄冬芽的磷含量均明顯高于對(duì)照組，且差異顯著.在第7，14，21，28，35 d，其較對(duì)照組分別高了37.70%，26.37%，29.43%，24.95%和21.58%，說(shuō)明單氰胺處理可減緩葡萄冬芽中磷含量的降低(圖7).試驗(yàn)組和對(duì)照組葡萄冬芽的鉀含量隨時(shí)間的變化也均呈下降趨勢(shì).在整個(gè)時(shí)間段中，試驗(yàn)組葡萄冬芽的鉀含量均明顯高于對(duì)照組，且差異顯著，在第 35 d，其高于對(duì)照組41.11%(圖8).綜上所述，單氰胺溶液處理‘水晶’葡萄冬芽的氮、磷、鉀含量均高于對(duì)照組，說(shuō)明單氰胺溶液處理可以提高葡萄冬芽中氮、磷、鉀含量，有利于葡萄冬芽的生長(zhǎng).

圖6 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的氮含量對(duì)比

圖7 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的磷含量對(duì)比

圖8 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理葡萄 冬芽的鉀含量對(duì)比

2.4 單氰胺處理對(duì)葡萄冬芽淀粉、可溶性糖、總碳含量和碳氮比的影響

試驗(yàn)組和對(duì)照組中葡萄冬芽的淀粉含量均隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，在第14，21，28，35 d 分別降低了6.80%，23.75%，46.39%和19.93%(圖9)；兩組中葡萄冬芽的可溶性糖含量均隨時(shí)間上下波動(dòng)，在第7，14，21，35 d，試驗(yàn)組葡萄冬芽的可溶性糖含量分別較對(duì)照組高11.07%，32.16%，14.20%和97.64%(圖10)；試驗(yàn)組葡萄冬芽的總碳含量在第21，28 d 較對(duì)照組分別低了14.20%和41.07%，在第7，35 d 較對(duì)照組分別高了20.89%、16.34%，而在第 14 d 與對(duì)照差異不顯著(圖11)；試驗(yàn)組葡萄冬芽的碳氮比則先上升后下降，在第7，14，21，28，35 d 較對(duì)照分別降低了34.55%，12.57%，27.83%，65.58%和61.45%，且差異顯著(圖12).綜上所述，單氰胺溶液處理和對(duì)照組的葡萄冬芽淀粉和總碳含量均逐漸下降；可溶性糖含量和碳氮比均呈現(xiàn)上下波動(dòng)趨勢(shì).在整個(gè)時(shí)間段中，單氰胺處理的葡萄冬芽中可溶性糖含量總體高于對(duì)照組，而淀粉含量和碳氮比均低于對(duì)照組.上述結(jié)果說(shuō)明，單氰胺能促進(jìn)葡萄冬芽淀粉水解，增加可溶性糖含量并提高其氮含量，降低碳含量，為葡萄冬芽的生長(zhǎng)提供能量.

圖10 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的可溶性糖含量對(duì)比

圖11 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的總碳含量對(duì)比

圖12 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的碳氮比對(duì)比

2.5 單氰胺處理對(duì)葡萄冬芽蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的影響

試驗(yàn)組和對(duì)照組葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間總體呈上升趨勢(shì)，且在整個(gè)時(shí)間段中，試驗(yàn)組葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量均明顯高于對(duì)照組，且差異顯著.在第7，14，21，28，35 d，試驗(yàn)組較對(duì)照組分別高了41.91%，40.51%，40.28%，90.23%和98.68%(圖13).而兩組葡萄冬芽中游離氨基酸含量隨時(shí)間均呈上下波動(dòng)的趨勢(shì)，且在整個(gè)時(shí)間段中，試驗(yàn)組葡萄冬芽的游離氨基酸含量總體比對(duì)照組高，在第14，21，28，35 d，分別高了161.92%，154.80%，47.52%和93.89%(圖14).綜上而言，單氰胺可促進(jìn)葡萄冬芽蛋白質(zhì)的合成，增加游離氨基酸含量，促進(jìn)冬芽生長(zhǎng).

圖13 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的蛋白質(zhì)含量對(duì)比

圖14 蒸餾水和2.5%單氰胺溶液處理 葡萄冬芽的游離氨基酸含量對(duì)比

3 討論

單氰胺作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)果樹萌芽、冬芽生長(zhǎng)，目前已在藍(lán)莓、桃、葡萄等多種果樹上成功應(yīng)用[22].李鵬飛等[23]利用單氰胺處理‘霞多麗’葡萄枝條，結(jié)果顯示單氰胺可打破葡萄休眠，提高葡萄發(fā)芽率和萌芽整齊度，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致.黃曉婧等[3]利用單氰胺處理‘夏黑’葡萄枝條，發(fā)現(xiàn)‘夏黑’葡萄的POD和SOD均顯著上升，并且處理組均明顯高于對(duì)照組，也與本試驗(yàn)結(jié)果較為一致.張昂等[24]利用單氰胺對(duì)‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄進(jìn)行處理，但其SOD活性變化為先下降后上升，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致.這主要是因?yàn)槠咸衙妊繒r(shí)間存在差異.而當(dāng)‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄萌芽后，其SOD活性也為上升趨勢(shì)，并且其單氰胺處理組明顯高于對(duì)照組，與本試驗(yàn)結(jié)果也較為一致.這也佐證了SOD活性是葡萄打破休眠，進(jìn)入萌芽的重要指標(biāo).然而，‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄萌芽后的POD活性呈下降趨勢(shì)，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致.因此在打破葡萄休眠，進(jìn)入萌芽這一過(guò)程中，引起POD活性變化的機(jī)制還需要進(jìn)行進(jìn)一步的探討.

黃曉婧等[3]利用單氰胺處理‘夏黑’葡萄后，其可溶性糖先升高后降低，并且在萌芽前，單氰胺處理后的可溶性糖含量高于對(duì)照組，而在萌芽后卻低于對(duì)照組.單氰胺處理‘夏黑’葡萄后，其淀粉含量下降，且對(duì)照組高于單氰胺處理組.這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果較為一致.譚一婷等[25]研究表明單氰胺處理后的不同葡萄品種中的可溶性糖和淀粉含量均高于對(duì)照，與本研究結(jié)果不一致.上述研究結(jié)果表明，在葡萄打破休眠進(jìn)入萌芽過(guò)程中，可溶性糖和淀粉含量的變化在不同葡萄品種中并沒(méi)有一致的變化規(guī)律，其原因還有待進(jìn)一步的探討.

氮、磷、鉀對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，并且氮、磷、鉀可從植株的老葉或枝條轉(zhuǎn)移至新葉或新芽，促進(jìn)新葉或新芽的生長(zhǎng).本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單氰胺處理‘水晶’葡萄冬芽的氮、磷、鉀、蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明氮、磷、鉀、蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量也在葡萄打破休眠后萌芽過(guò)程中具有重要作用.總體而言，單氰胺處理可增加‘水晶’葡萄淀粉水解，提高SOD和POD活性，促進(jìn)葡萄枝條中氮、磷、鉀轉(zhuǎn)移至冬芽，提高葡萄冬芽中蛋白質(zhì)合成，使葡萄冬芽提前萌發(fā)并生長(zhǎng)旺盛.

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)單氰胺處理后‘水晶’葡萄冬芽的萌發(fā)情況觀察及其生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)：在處理后第 35 d，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組葡萄的萌芽時(shí)間提前了 14 d，冬芽萌芽率和平均芽長(zhǎng)度分別是對(duì)照組的2.1，1.9倍；試驗(yàn)組葡萄冬芽的SOD、POD活性較對(duì)照組分別增加了13.70%和140.57%，其氮、磷、鉀、可溶性糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量較對(duì)照組分別增加了212.41%，21.58%，41.11%，97.64%，98.68%，93.89%；而其淀粉、碳氮比較對(duì)照組分別降低了19.93%和61.15%.由此可見，POD活性、氮、可溶性糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量是單氰胺解除葡萄冬芽休眠的主要生理因子.綜上所述，2.5%單氰胺處理‘水晶’葡萄后，可引起葡萄冬芽?jī)?nèi)生理變化，縮短葡萄冬芽萌芽周期，提高萌芽率和萌芽整齊度，促進(jìn)冬芽的生長(zhǎng).