李潤(rùn)根，李嘉妮，李 楠，黃 琪，艾芬婷，趙雅芳

(宜春學(xué)院 江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000)

百合(Liliumspp.)屬單子葉植物亞綱百合科百合屬多年生草本植物[1]，具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值.食用方面，百合含有豐富的皂苷、生物堿類(lèi)、酚酸甘油酯、磷脂類(lèi)、微量元素以及糖類(lèi)等化學(xué)成分；藥理方面，百合有抗疲勞、抗腫瘤、降血糖等作用[2].近年來(lái)百合連作障礙日益嚴(yán)重，對(duì)百合的產(chǎn)量、品質(zhì)及市場(chǎng)價(jià)格影響很大.而百合枯萎病是引起連作障礙的重要病害，對(duì)產(chǎn)量和質(zhì)量造成不同程度損失[3].百合枯萎病也稱(chēng)根腐病、莖腐病，由致病性尖孢鐮刀菌侵染引起的植物枯萎病是世界性的土傳真菌病害之一[4]，也是百合病害中最嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病害之一.目前防治措施主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治[5].在大力倡導(dǎo)環(huán)境保護(hù)和食品安全的今天，生防發(fā)揮的作用越來(lái)越明顯.目前已報(bào)道的對(duì)枯萎病具有拮抗效果的生防細(xì)菌主要為芽孢桿菌.賈熙超等[6]發(fā)現(xiàn)多粘類(lèi)芽孢桿菌JNJX-2對(duì)棉花枯萎病有良好的生防效果；李晉等[7]發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌ZJT2在正常土壤中該菌株對(duì)西瓜枯萎病病菌的防治效果高達(dá)100%.武志江等[8]報(bào)道了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為東方百合枯萎病拮抗細(xì)菌；楊謝斌[9]分離篩選出對(duì)龍牙百合枯萎病有顯著抑制作用的拮抗菌株枯草芽孢桿菌Y35.但目前有關(guān)百合枯萎病拮抗細(xì)菌為貝萊斯芽孢桿菌相關(guān)報(bào)道比較少.

本研究擬采用土壤稀釋法和平板對(duì)峙法等方法，篩選和鑒定龍牙百合枯萎病病菌的拮抗細(xì)菌，利用Salkowski比色法和鉬銻抗比色法測(cè)定拮抗細(xì)菌抗病能力、分泌IAA及其溶磷能力.獲取具有拮抗和促生雙重功能的優(yōu)良菌株，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其菌株，以期為百合尖孢鐮刀菌的生防應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 百合植株根際土壤及病原菌

1)連根帶土的挖取連作且健康的卷丹百合、龍牙百合和鐵炮百合，將植株“抖根”后，用刷子將根上剩余的土壤輕輕刷下來(lái)，得到根際土壤，放在4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆?

2)病原菌為實(shí)驗(yàn)室從龍牙百合發(fā)病的鱗片上分離純化而來(lái)，為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基[10]、King培養(yǎng)基、PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(pH=7.1)、孟金娜培養(yǎng)基(pH=7.2)[11].

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離、純化與篩選

1)菌株的分離：根際土壤樣品菌株的分離采取土壤稀釋法[12].10 g土樣加90 ml無(wú)菌水，200 r/min振蕩30 min，制成初始土壤懸浮液.分別稀釋至10-3、10-4、10-5和10-6這4個(gè)梯度，取100 μL各質(zhì)量濃度菌液分別涂布于添加重鉻酸鉀的LB培養(yǎng)基，3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長(zhǎng)情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個(gè)菌落.

2)菌株的純化：對(duì)形態(tài)差異明顯的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化3～4次.

3)菌株的篩選：平板對(duì)峙法篩選出具有活性的菌株，觀察和培養(yǎng)，并用革蘭氏染色液試劑盒對(duì)其進(jìn)行染色.

1.2.2 抗病能力的測(cè)定

將病原菌用5 mm打孔器制成菌餅倒接于PDA平板中央，活化1 d后，在病原菌左右兩側(cè)(距病原菌2.5 cm)接種待測(cè)菌.3次重復(fù)，以不接種待測(cè)菌為對(duì)照.28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察病原菌的形態(tài)，記錄抑菌帶寬和抑菌率并判斷有無(wú)抗菌活性[13].計(jì)算方式如下：

1.2.3 細(xì)菌分泌IAA特性測(cè)定

1)采用S2比色液[14]，其測(cè)定范圍為5～200 μg/mL，超過(guò)100 μg/mL需要稀釋.

2)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將純的3-IAA配置濃度為2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，45，50 mg/L的IAA梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液與S2試劑按1∶1體積混合，室溫下避光放置30 min，分別測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液OD530(在波長(zhǎng)530 nm下的吸光值)，以IAA濃度為橫坐標(biāo)，OD530值為縱坐標(biāo)得到IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線.

3)定量測(cè)定：采用Salkowski比色法.將培養(yǎng)12 d的培養(yǎng)液在4 ℃環(huán)境下，10 000 r/min離心15 min，取上清液4 ml加S2比色液4 ml，黑暗下靜置30 min后，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD530，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各待測(cè)菌液的IAA濃度.

1.2.4 溶磷能力的測(cè)定

將500 μL各菌株的菌懸液分別接種于PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液和蒙金娜培養(yǎng)液中，每個(gè)處理3次重復(fù)，放置于28 ℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)10 d.用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)10 d后的各菌株培養(yǎng)液pH值的變化情況.培養(yǎng)10 d后加入無(wú)磷活性炭1 g，150 r/min震蕩30 min.再將培養(yǎng)液在4 ℃環(huán)境下，15 000 r/min離心 15 min，取上清液用鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷增量[15].計(jì)算公式如下：

P=K×V/V1，

式中：P為有效磷增量；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線上顯色液的磷質(zhì)量濃度(mg/L)；V1為顯色時(shí)吸取上清液的體積(mL)；V為顯色時(shí)溶液定容的體積(mL).

1.2.5 拮抗菌株分子生物學(xué)鑒定

將上述分離純化得到的優(yōu)良菌株進(jìn)行DNA的提取，然后選用通用引物16s(27F/1492R)和專(zhuān)用引物gyrA(gyrA-R/gyrA-F)[16]進(jìn)行基因序列擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，進(jìn)而初步鑒定出所分離的菌株.

2 研究結(jié)果

2.1 百合根際土壤拮抗細(xì)菌的形態(tài)特征

菌株來(lái)源于龍牙、鐵炮、卷丹百合的根際土壤，通過(guò)土壤稀釋法，共分離了200余株細(xì)菌，其中具有拮抗作用的菌株有5株，分別為：假35、J45、TP54、TP58、J67.對(duì)這5種細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，通過(guò)培養(yǎng)和觀察，5株細(xì)菌菌落均為近白色(圖1).其中J67、TP58、TP54為革蘭氏陽(yáng)性菌株，J45、假35為革蘭氏陰性菌株(圖2).

(a)TP58 (b)J67 (c)J 45 (d)假35 (e)TP54

(a)TP58 (b)J67 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

2.2 拮抗細(xì)菌抗病能力

28 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察菌株與病原菌的抑菌情況(圖3).測(cè)量各菌株平板里病原菌菌落的直徑和病原菌菌落與各拮抗菌株的距離，計(jì)算其抑菌率和抑菌帶寬(表1).5種拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌(LD12)都有一定的抗病能力，抑菌率有所不同.其中J67的抗病能力最好，達(dá)到52.47%，TP54和TP58的抑菌率也在40%以上，顯著高于假35和J45.

(a)J67 (b)TP58 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

表1 各株拮抗細(xì)菌抑菌率和抑菌帶

2.3 拮抗細(xì)菌分泌IAA的能力

定量測(cè)定時(shí)用Salkowski比色法，以IAA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD530值為縱坐標(biāo)，得到IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

YOD530=0.040XIAA+0.014，(R2=0.998).

測(cè)得5株菌株分泌IAA的量為4.87～10.05 mg/L(圖4)，其中TP54、TP58、J67分泌IAA量較多，分別為10.05，8.65，8.97 mg/L，顯著高于假35和J45，說(shuō)明此3株菌株有很好的促生作用.

圖4 各株拮抗細(xì)菌分泌IAA測(cè)定結(jié)果

2.4 各菌株溶磷能力測(cè)定

微生物溶磷可以通過(guò)酶解作用和有機(jī)酸酸解作用，酸性物質(zhì)可使磷酸鹽溶解，但當(dāng)菌株處于磷酸鹽饑餓狀態(tài)時(shí)，會(huì)合成堿性的磷酸酶[17].孟金娜培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，對(duì)各菌株的有效磷進(jìn)行測(cè)定，5株菌株中有效磷增量為0.35～0.89 mg/L(表2)，而PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，菌株的有效磷增量為0.32～1.17 mg/L(表3).無(wú)論是無(wú)機(jī)磷還是有機(jī)磷，有效磷增加量均較少，說(shuō)明溶磷效果較差.假35在PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜培養(yǎng)基中pH有上升的趨勢(shì)，其余菌株pH均下降.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5株菌株中培養(yǎng)液pH變化與菌株有效磷增量沒(méi)有很好的線性關(guān)系.

表2 各菌株在孟金娜培養(yǎng)液中 10 d后有效磷增量、pH值變化

表3 各菌株在PKO培養(yǎng)液中 10 d后有效磷增量、pH值變化

2.5 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)對(duì)菌株抗病能力、分泌IAA能力的測(cè)定，最終篩選出了3株抗性活性菌株.使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒分別提取這3株細(xì)菌的DNA，經(jīng)通用引物16S和專(zhuān)用引物gyrA擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收.將回收的片段送至上海生工測(cè)序.測(cè)序得到J67、TP54和TP58分別為1 489，1 489，1 490 bp和940，934，929 bp 的片段.將所測(cè)的16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的序列進(jìn)行基因比對(duì)和同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5、圖6)，確定分離的菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis).

3 小結(jié)與討論

徐劉平等[18，19]發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌可以起到抗生、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)以及寄生和降解植物病原菌細(xì)胞的能力，也可以分泌一些生長(zhǎng)物質(zhì)來(lái)促進(jìn)植株的生長(zhǎng).宋文欣[20]等篩選出一株枯草芽孢桿菌可以同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶、蛋白質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)，防治桑枝枯菌核病病菌效果達(dá)85.71%.本試驗(yàn)從鐵炮百合和卷丹百合等根際土中分離到TP54、TP58、J67等菌株，對(duì)百合尖孢鐮刀菌抑制作用較好，且具有分泌IAA和溶磷能力，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定3個(gè)菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis，3個(gè)菌株具有較好的生防潛力，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

圖5 TP54、TP58、J67基于16s序列采用最大擬然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 TP54、TP58、J67基于gyrA序列采用最大擬然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

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