時 杰 王永安 孫基澤 石 慧 盛 潔 姚 姚 嵇 姍*

(1.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院,江蘇 無錫 214000;2.安徽醫(yī)科大學(xué),合肥 230000;3.東華理工大學(xué),南昌 330000)

肺癌是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一[1]。其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌發(fā)病率的85%,其5 年生存率在4%～17%[2]。目前,肺癌的臨床治療仍以手術(shù)與化療為主,然而部分患者因為身體差等原因而不適合化療。因此,開發(fā)高效低毒治療肺癌的藥物迫在眉睫。

硒作為人體必需的微量元素,具有抗癌、抗氧化、增強免疫力及抗病毒等重要功能[3-4]。據(jù)報道,生理水平的硒具有一定的生物學(xué)效應(yīng),例如對心臟疾病及消化系統(tǒng)疾病等具有強大的保護作用[5]。此外,其他研究表明,在適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷥?nèi),超營養(yǎng)劑量的硒可以抑制癌細胞增殖而對正常細胞的副作用較小[6]。因此,硒是一種潛在的抗癌藥物,對癌細胞的增殖具有抑制作用,但硒抑制A549細胞增殖的作用機制仍不明確。

鐵死亡是一種新的細胞程序性死亡模式,在細胞形態(tài)、生化特征和遺傳水平上與凋亡、壞死和自噬不同,其特征是鐵依賴性的脂質(zhì)過氧積累達到致死水平[7-9]。鐵是人體微量元素之一,過量的亞鐵離子會催化芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS,進而促進細胞脂質(zhì)氧化損傷導(dǎo)致細胞發(fā)生鐵死亡[10]。研究表明,在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在鐵代謝失調(diào)[11],誘導(dǎo)細胞發(fā)生鐵死亡可以抑制癌細胞增殖[12]。此外,在低劑量下,硒表現(xiàn)出抗氧化特性,保護細胞免受氧化損傷,而高劑量的硒通過增加活性氧(ROS)水平誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生鐵死亡[12]。目前尚未有研究探討亞硒酸鈉是否能誘導(dǎo)肺癌A549細胞發(fā)生鐵死亡。因此,本研究以A549細胞為研究對象,通過檢測亞硒酸鈉對A549細胞增殖及鐵死亡的影響,進而探究亞硒酸鈉是否能誘導(dǎo)A549細胞鐵死亡及其相關(guān)機制,為其臨床輔助治療肺癌提供理研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 細胞培養(yǎng)

將A549細胞(武漢普諾賽)置于5 mL的DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽)(90%DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)中,在細胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中培養(yǎng)24 h(5% CO2、37 ℃)。

1.2 細胞增殖抑制率檢測

將A549細胞以104/孔的密度接種于96孔板中。細胞貼壁后,分別加入含不同濃度亞硒酸鈉(0、5、10、15和20 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后每孔加入100 μL CCK-8溶液(日本同仁化學(xué)研究所,10 μL CCK-8+90 μL DMEM)在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標儀(美國ThermoFisher公司)測定450 nm處的OD值。然后計算細胞增殖率,繪制細胞增殖曲線,得到半數(shù)抑制濃度值用于以下實驗。每個實驗重復(fù)三次,數(shù)據(jù)以Mean±SD的形式表示。

1.3 細胞計數(shù)實驗

將肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,每管加入1 mL含有10%臺盼藍染液(索萊寶生物科技有限公司)的DMEM培養(yǎng)基并吹勻,隨后用自動細胞計數(shù)儀(上海瑞宇生物科技有限公司)進行細胞計數(shù),每個實驗重復(fù)三次,數(shù)據(jù)以Mean±SD的形式表示。

1.4 亞鐵離子含量檢測

將肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,按照細胞亞鐵離子檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)說明,測定對照組與治療細胞內(nèi)亞鐵離子含量。

1.5 ROS水平檢測

將肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,參照ROS檢測試劑盒(碧云天生物科技研究所)說明,每管加入10 μmol/L 活性氧熒光探針(DCFH-DA)重懸細胞并避光孵育30 min,采用FACSVERSE流式細胞儀(美國BD公司)對樣本進行分析。每個實驗重復(fù)三次,數(shù)據(jù)以Mean±SD的形式表示。

1.6 MDA水平檢測

將肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,按照MDA檢測試劑盒(碧云天生物科技研究所)說明,測定對照組與治療細胞內(nèi)MDA水平。

1.7 GSH與GPX4水平檢測

將肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,按照GSH(南京建成生物工程試劑公司)與GPX4(江蘇酶免實業(yè)有限公司)檢測試劑盒說明,測定對照組與治療細胞內(nèi)GSH與GPX4水平。

1.8 MMP檢測

肺癌A549細胞按照5×105/孔的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,細胞貼壁后,治療組加入10 μmol/L的亞硒酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后消化、離心、收集細胞于離心管中,參照MMP檢測試劑盒說明,每管加入500 μL JC-1染液重懸細胞,采用FACSVERSE流式細胞儀對樣本進行分析。每個實驗重復(fù)三次,數(shù)據(jù)以Mean±SD的形式表示。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用Origin 6.0及Prism5.0軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差Mean±SD表示,組間的數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本t檢驗分析),P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉抑制肺癌A549細胞增殖

CCK-8結(jié)果顯示,亞硒酸鈉對A549細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10 μmol/L(圖1a),細胞計數(shù)實驗結(jié)果顯示對照組與治療組的總細胞數(shù)分別為(396.3±12.6)萬及(162.3±2.8)萬(圖1b),上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著抑制A549細胞的增殖。

2.2 亞硒酸鈉誘導(dǎo)肺癌A549細胞內(nèi)鐵過載

亞鐵離子累積是細胞發(fā)生鐵死亡的重要標志,本實驗采用比色法檢測細胞內(nèi)的亞鐵離子含量。結(jié)果顯示治療組的亞鐵離子含量為對照組的(2.28±0.25)倍(圖2),上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著誘導(dǎo)A549細胞內(nèi)鐵過載。

圖2 分光光度法檢測亞硒酸鈉對A549細胞亞鐵離子含量的影響Figure 2 Effects of sodium selenite on ferrous ion content of A549 cells detected by spectrophotometry.

2.3 亞硒酸鈉升高肺癌A549細胞內(nèi)ROS水平

流式結(jié)果顯示治療組的ROS含量為對照組的(2.3±0.12)倍(圖3),上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著升高A549細胞內(nèi)ROS水平。

圖3 流式細胞儀檢測A549細胞ROS含量(a)亞硒酸鈉處理細胞24 h,DCFH-DA染色后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞ROS含量;(b)以對照組百分比計算A549細胞內(nèi)ROS含量Figure 3 ROS content of A549 cells detected by flow cytometry(a)The cells were treated with sodium selenite for 24 h,and the ROS content was detected by flow cytometry after DCFH-DA staining;(b)The ROS content in A549 cells was calculated as the percentage of the control group.

2.4 亞硒酸鈉升高肺癌A549細胞內(nèi)MDA水平

MDA水平升高是細胞發(fā)生鐵死亡的重要標志,為進一步分析細胞膜脂質(zhì)氧化情況,本實驗采用分光光度法檢測細胞內(nèi)的MDA水平。結(jié)果顯示治療組的MDA含量為對照組的(1.87±0.27)倍(圖4),上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著升高A549細胞內(nèi)MDA水平。

圖4 分光光度法檢測亞硒酸鈉對A549細胞MDA含量的影響Figure 4 Effect of sodium selenite on MDA content of A549 cells detected by spectrophotometry.

2.5 亞硒酸鈉降低肺癌A549細胞內(nèi)GSH與GPX4水平

GSH是細胞內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì),為進一步分析細胞內(nèi)GSH水平,本實驗采用分光光度法檢測細胞內(nèi)的GSH含量。結(jié)果顯示治療組的GSH含量為對照組的(0.77±0.04)倍(圖5a);此外,GPX4含量為對照組的(0.69±0.03)倍(圖5b)。上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著降低A549細胞內(nèi)GSH與GPX4水平。

圖5 分光光度法檢測亞硒酸鈉對A549細胞GSH與GPX4水平的影響Figure 5 Effect of sodium selenite on GSH and GPX4 levels in A549 cells by spectrophotometry.

2.6 細胞線粒體膜電位變化

流式結(jié)果顯示治療組的MMP含量為對照組的(0.13±0.04)倍(圖6),上述結(jié)果提示亞硒酸鈉顯著降低A549細胞內(nèi)MMP水平。

圖6 流式細胞儀檢測A549細胞MMP(a)亞硒酸鈉處理細胞24 h,JC-1染色后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞MMP水平;(b)紅色/綠色熒光的比值用于衡量MMP水平Figure 6 Flow cytometry detection of MMP in A549 cells (a)The cells were treated with sodium selenite for 24 h,and the MMP level was detected by flow cytometry after JC-1 staining;(b)The ratio of red/green fluorescence was used to measure MMP levels.

3 討論

本研究通過細胞增殖實驗、細胞計數(shù)實驗、流式細胞術(shù)、亞鐵離子及MDA檢測等實驗表明亞硒酸鈉可以抑制A549細胞增殖,同時還表明亞硒酸鈉抑制A549細胞增殖與細胞發(fā)生鐵死亡有關(guān)。

亞硒酸鈉屬于無機硒,具有廣泛的抗癌活性。有研究顯示亞硒酸鈉可以通過增加氧化物的產(chǎn)生、降低線粒體膜電位及激活自噬等方式誘導(dǎo)癌細胞凋亡[12-15]。鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞死亡形式,其主要特征為鐵過載及脂質(zhì)過氧化。誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡相對于傳統(tǒng)腫瘤治療具有其獨特的優(yōu)勢,近年來逐步成為研究熱點。此外,最近研究報道亞硒酸鈉可以通過增加活性氧(ROS)水平誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生鐵死亡[12]。本研究通過CCK-8及細胞計數(shù)實驗表明亞硒酸鈉可以抑制A549細胞的增殖,并且隨著亞硒酸鈉濃度的升高,其抑制活性不斷增強。此外,通過分光光度法檢測細胞內(nèi)亞鐵離子、MDA及其GSH含量,流式細胞儀檢測MMP及ROS水平,Western Blot檢測GPX4水平發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉可以誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生鐵死亡,上述結(jié)果提示亞硒酸鈉可以通過誘導(dǎo)A549細胞鐵死亡從而抑制細胞增殖。

GSH是細胞抗氧化系統(tǒng)內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì),而GPX4是內(nèi)源性抑制鐵死亡的脂質(zhì)過氧化物酶,起到抑制脂質(zhì)過氧化的作用[16]。有研究表明GPX4在鐵死亡過程中的表達依賴于GSH的存在[17]。因此,細胞內(nèi)GSH耗竭會降低GPX4的表達,GPX4的降低是細胞發(fā)生鐵死亡的重要標志[18]。本研究結(jié)果表明亞硒酸鈉可以引起A549細胞內(nèi)GSH與GPX4表達水平降低,提示亞硒酸鈉可以通過ROS/GSH/GPX4信號軸誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生鐵死亡。

4 結(jié)論

綜上所述,亞硒酸鈉通過抑制肺癌A549細胞增殖,降低細胞內(nèi)線粒體膜電位水平,調(diào)節(jié)ROS/GSH/GPX4信號軸誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生鐵死亡。上述研究對亞硒酸鈉在肺癌防治方面提供一定的指導(dǎo)意義。此外,本實驗初步探索了亞硒酸鈉誘導(dǎo)肺癌A549細胞鐵死亡作用及其可能機制,為亞硒酸鈉在肺癌的臨床輔助治療提供了一定的理論依據(jù)。