侯巖巖，李曼，葉國(guó)柳

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽蚌埠 233004

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種常見的慢性炎癥性婦科疾病，子宮內(nèi)膜組織定植和生長(zhǎng)在子宮腔以外解剖部位（主要在盆腔腹膜和卵巢），是育齡期婦女盆腔疼痛和不孕的重要危險(xiǎn)因素之一［1］。研究［2］表明，細(xì)胞焦亡促進(jìn)EMS 中的炎癥反應(yīng)。消皮素D（GSDMD）是一種新型的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白，是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白，介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥性壞死，當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源性和外源性刺激后，激活半胱天冬氨酸酶（Caspase-1），活化的Caspase-1 促使IL-1β 的前體產(chǎn)生成熟的IL-1β［3］，同時(shí)切割GSDMD 被產(chǎn)生N 末端（GSDMD-N），細(xì)胞發(fā)生腫脹、溶解，最終破裂死亡［4］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，廣泛分布于機(jī)體的組織器官中，參與DNA 的重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞復(fù)制及分化等生命活動(dòng)［5］，其可通過誘發(fā)細(xì)胞焦亡表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝衰竭患者免疫功能障礙和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但關(guān)于HMGB1在EMS 組織中的表達(dá)，以及HMGB1、GSDMD、IL-1β表達(dá)相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。本研究觀察了EMS組織中HMGB1、GSDMD表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022 年4 月—2023 年4 月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的EMS患者80例，年齡（37.28 ± 7.04）歲；按1997 年美國(guó)生育協(xié)會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期［6］，Ⅰ～Ⅱ期有19例，Ⅲ～Ⅳ期有51例。另選因子宮平滑肌瘤并排除EMS 行全子宮切除術(shù)患者70例，年齡（44.84 ± 7.05）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診異位組患者均診斷為EMS；②臨床資料完整；③至少3個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有胚胎停育史；②子宮先天發(fā)育不全；③合并其他腫瘤、急慢性感染性疾病等。手術(shù)留取EMS 異位內(nèi)膜組織80 例份（觀察組）及子宮平滑肌瘤正常內(nèi)膜組織70例份（對(duì)照組）。兩組一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)號(hào)：2023YJS169），患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 HMGB1抗體購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：A19529），GSDMD 抗體（批號(hào)：AF4012）、IL-1β 抗體（批號(hào)：AF5103）均購(gòu)于江蘇親科生物有限公司。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中HMGB1、GSDMD、IL-1β 檢測(cè) 采用免疫組化法。標(biāo)本固定24 h，石蠟包埋，選取厚度4 μm 切片，二甲苯脫蠟，水化，添加檸檬酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗放于4 ℃冰箱濕盒內(nèi)過夜，加入二抗，DAB 顯色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分，無(wú)色為陰性、淡黃色為弱陽(yáng)性、棕黃色為陽(yáng)性、褐色/黑色為強(qiáng)陽(yáng)性，分別計(jì)為0、1、2、3 分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分，<10%、11%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)為1、2、3、4 分；兩項(xiàng)評(píng)分相乘，<3 分判定為陰性，≥3 分判定為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HMGB1、GSDMD、IL-1β 陽(yáng)性率比較 觀察組HMGB1、GSDMD、IL-1β 陽(yáng)性率分別為77.50%（62/80）、66.25%（53/80）、68.75%（55/80），對(duì)照組分別為32.96%（23/70）、22.86%（16/70）、17.14%（12/70），兩組比較，P均<0.05。HMGB1、GSDMD、IL-1β在兩內(nèi)膜組織中的免疫組化染色圖見圖1。

圖1 HMGB1、GSDMD、IL-1β在兩內(nèi)膜組織中的免疫組化染色圖（SP，×200）

2.2 HMGB1、GSDMD、IL-1β 表達(dá)與EMS 臨床病理特征的關(guān)系 HMGB1、GSDMD、IL-1β 表達(dá)與EMS臨床病理特征的關(guān)系見表1，由表1 可知，HMGB1、GSDMD、IL-1β 表達(dá)與EMS 臨床分析有關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、痛經(jīng)程度和囊腫直徑無(wú)關(guān)（P均>0.05）。

表1 HMGB1、GSDMD、IL-1β表達(dá)與EMS臨床病理特征的關(guān)系

2.3 觀察組HMGB1、GSDMD、IL-1β相關(guān)性分析 觀察組HMGB1與GSDMD、IL-1β 表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.577、0.717，P均<0.05），GSDMD 與IL-1β 表達(dá)呈正相關(guān)（r為0.797，P<0.05）。

3 討論

EMS 是一種復(fù)雜的綜合征，其特征是慢性炎癥性、雌激素依賴性疾?。?］，嚴(yán)重威脅女性生育能力和個(gè)人生活質(zhì)量。探究影響EMS 發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，對(duì)改善EMS 患者的生活質(zhì)量及預(yù)后具有重要的意義［8］。據(jù)報(bào)道，HMGB1是一種參與EMS 發(fā)展的炎癥介質(zhì)，EMS 患者血清、組織中HMGB1 表達(dá)上調(diào)，其有作為診斷EMS 的生物標(biāo)志物的潛能［9］。考慮到HMGB1 的活化與焦亡密切相關(guān)，HMGB1 可與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合誘發(fā)焦亡，進(jìn)一步研究HMGB1 在EMS 患者觀察組織中是否發(fā)生焦亡，GSDMD、IL-1β 作為細(xì)胞焦亡的常見因子，是否在EMS 患者觀察組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，以及HMGB1 是否與細(xì)胞焦亡因子GSDMD、IL-1β 具有協(xié)同性，是研究者一直關(guān)注的熱點(diǎn)。

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源性或外源性損傷時(shí)，其釋放到細(xì)胞外，起到損傷相關(guān)分子模式（DAMP）的作用，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而在EMS 中起到關(guān)鍵致炎作用［10］。先前研究表明，單獨(dú)的HMGB1 不能激活NLRP3 炎性小體，也不能誘導(dǎo)IL-1β 和IL-18 的表達(dá)，但HMGB1 釋放到細(xì)胞外后，會(huì)與晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）受體或toll 樣受體（TLR）-2 和4 結(jié)合，以DAMP 分子的形式啟動(dòng)焦亡作用并引發(fā)炎癥反應(yīng)［11］。因此，HMGB1/RAGE 信號(hào)通路可能在EMS 焦亡釋放IL-1β 和IL-18 的第一步中起重要作用［12］。本研究顯示，與對(duì)照組對(duì)比，子宮內(nèi)膜異位癥患者HMGB1 陽(yáng)性率高，Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，說明子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與HMGB1 有關(guān)，且HMGB1 水平隨著疾病進(jìn)展不斷上升。GSDMD是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者，在自身免疫性疾病或炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵功能。在EMS 組織中，炎癥因子IL-1β 和IL-18 的表達(dá)和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著增加，這些因子通過激活巨噬細(xì)胞［13］，釋放炎性小體，活化Caspase-1，一方面，活化的Caspase-1切割GSDMD，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞通透性增加，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，促進(jìn)焦亡和炎癥反應(yīng)［14］。另一方面，活化的Caspase-1 分泌IL-1β 和IL-18，形成反饋環(huán)，進(jìn)一步導(dǎo)致焦亡和子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移［15］。故HMGB1/RAGE 信號(hào)通路可能通過影響經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡在EMS 中發(fā)揮重要作用，誘發(fā)異位內(nèi)膜細(xì)胞級(jí)聯(lián)放大的炎癥過程，引起異位內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、增生及新血管生成機(jī)制，促進(jìn)異位病灶的形成，最終導(dǎo)致EMS 的發(fā)生、發(fā)展。本研究還顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中GSDMD、IL-1β 陽(yáng)性率高，Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥高于Ⅰ～Ⅱ期。通過相關(guān)性分析證實(shí)，HMGB1 與GSDMD、IL-1β 在EMS表達(dá)中存在明顯正相關(guān)性，說明HMGB1、GSDMD、IL-1β 三種因子在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中具有一定的協(xié)同作用，三者聯(lián)合進(jìn)一步加重EMS 的發(fā)生發(fā)展，因此HMGB1 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡將可能成為EMS的潛在且有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。

總之，HMGB1、GSDMD、IL-1β 在EMS 中表達(dá)上調(diào)，三指標(biāo)異常表達(dá)可能與EMS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此在子宮內(nèi)膜異位癥的診斷與分期方面具有較高的參考價(jià)值。