畢莉斯，謝春祥，趙榮華，劉樹民?

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江蟾寶生物科技發(fā)展有限公司，黑龍江 鶴崗 154100）

調(diào)查顯示，80%的肺癌患者就診時(shí)已是中晚期，其五年生存率不足14%［1］。大量研究表明，中醫(yī)藥在肺癌治療中具有多方面的優(yōu)勢(shì)和作用，不僅可以對(duì)腫瘤進(jìn)行有效的控制，還能改善患者的免疫功能和生活質(zhì)量，減輕藥物的毒副作用，提高治療效果和患者的生存率［2-4］。

復(fù)方蟾酥膠囊由蟾酥粉、蟾皮、龜甲、三棱、莪術(shù)和黃芪組成，具有解毒消腫、止痛、開竅醒神功效。以蟾酥為君藥進(jìn)行組方，其中龜甲滋陰潛陽(yáng)、退熱除蒸、軟堅(jiān)散結(jié)，三棱和莪術(shù)破血行氣、消積止痛，黃芪補(bǔ)氣健脾、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、養(yǎng)血生津、行滯通痹、斂瘡生肌、托毒排膿，具有抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)、遷移及一定程度的抗化療藥物耐藥的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6J小鼠Lewis肺癌模型，采用不同劑量復(fù)方蟾酥膠囊（低、中、高劑量，分別為標(biāo)準(zhǔn)劑量的0.5、1、2倍）進(jìn)行治療，采用ELISA 法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blot）、HE染色檢測(cè)小鼠腫瘤組織中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)及肺組織病理情況，明確復(fù)方蟾酥膠囊對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

1 材料

1.1 藥物

復(fù)方蟾酥膠囊組成：蟾酥粉、蟾皮、龜甲、三棱、莪術(shù)和黃芪，由黑龍江蟾寶生物科技發(fā)展有限公司提供成方膠囊制劑，規(guī)格：0.35 g/粒，藥方來(lái)源和藥物含量暫屬保密階段。注射用順鉑粉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C14452924）。

1.2 動(dòng)物

60 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量（20 ± 2）g。均自由飲水及飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20 ± 2）℃，相對(duì)濕度45%～70%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞株

具有自發(fā)肺轉(zhuǎn)移潛能的高轉(zhuǎn)移小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞株（LLC），移植率100%，購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 儀器

臺(tái)式低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：SC-04）；倒置顯微鏡（日本東京OLYMPUS，型號(hào)：CKX3-SLP）；游標(biāo)卡尺（上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：MNT-150）；超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BIOsafe12）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（哈爾濱菲詩(shī)科技有限公司，型號(hào)：C10228）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：HF90）；酶標(biāo)儀（TECAN，型號(hào)：AP1603）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD，型號(hào)：Mini-Protean）；轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)BIO-RAD，型號(hào)：DYC-ZY2）；實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR（Themo Fisher Scientific，型號(hào)：Detecting System）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope 6200）；石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica，型號(hào)：EG1160）；病理組織切片機(jī)（德國(guó)Leica，型號(hào)：HS-2205）。

1.5 試劑

優(yōu)級(jí)胎牛血清（貨號(hào)：BL201A）、DMEM 培養(yǎng)液（貨號(hào)：BL304A）、胰酶細(xì)胞消化液（貨號(hào)：BL512A）、青霉素-鏈霉素溶液（貨號(hào)：BL505A）、1 × PBS 緩沖液（貨號(hào)：BL302A）均北京蘭杰柯科技有限公司。

小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA科研試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)：202305）；Toyal RNA提取試劑（TAKARA，批號(hào)：910819109）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，批號(hào)：RR047A）、2 × SYBR Green（Selleck，批號(hào)：B21702）；蛋白裂解液（貨號(hào)：G2038-100 ML）、電泳液（貨號(hào)：CR2105176）、電轉(zhuǎn)液（貨號(hào)：G2057-1L）（武漢塞維爾生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010S）；Caspase-3 PIZ 兔抗（Selleck，批號(hào)：A5357），Anti-VEGF 兔抗（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：GB11034B），GAPDH兔抗（Selleck，批號(hào)：A5028），二抗羊抗兔IgG（H + L）-HRP（安諾倫生物科技有限公司，批號(hào)：BS13278）。

2 方法

2.1 模型小鼠的建立

復(fù)蘇培養(yǎng)LLC 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞，使用PBS 稀釋細(xì)胞至2 × 106個(gè)/mL，吸取細(xì)胞懸液后，于C57BL/6J 小鼠右腋皮下進(jìn)行注射（0.2 mL/只）。模型小鼠接種成功后，1周內(nèi)于小鼠右腋下可觸及腫塊。

2.2 分組及用藥方法

10 只空白組不予處理；腫瘤體積大于50 mm3時(shí)將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。模型組灌胃生理鹽水；復(fù)方蟾酥膠囊組根據(jù)人的使用劑量（2.1 g/70 kg），按照體表面積折算法進(jìn)行人和小鼠等效劑量換算，將小鼠中劑量代替人臨床劑量。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究探索，本研究將復(fù)方蟾酥膠囊用藥量分別定為低劑量0.136 5 g/（kg·d）、中 劑量0.273 g/（kg·d）、高 劑量0.546 g/（kg·d），將膠囊內(nèi)容物溶解于去離子水中灌胃給藥，0.2 mL/只；順鉑組給予順鉑隔日腹腔注射給藥，5 mg/（kg·d），0.2 mL/只。每日觀察精神狀態(tài)、活動(dòng)度，隔2 日測(cè)體重、腫瘤體積及飲食飲水量，共給藥14 d。第15天，脫頸處死所有小鼠剝?nèi)∧[瘤及肺組織。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 腫瘤抑制率

給藥14 d 后，各組小鼠脫頸處死，剝離腫瘤組織，稱質(zhì)量。

2.3.2 ELISA法檢測(cè)TNF-α含量

按照1 mg 加入9 μL PBS 緩沖液的比例研磨腫瘤組織，提取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀中450 nm 處測(cè)定48 孔板各孔的OD 值，再計(jì)算TNF-α含量。

2.3.3 Real-time PCR 檢 測(cè) Caspase-3、VEGF mRNA的表達(dá)

使用Trizol 試劑提取腫瘤細(xì)胞的總RNA。提取后，對(duì)RNA 進(jìn)行濃度測(cè)量，并進(jìn)行配平以確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。采用了熒光染料SYBR Green 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。PCR 反應(yīng)體系總共為20 μL，其中包括10 μL的SYBR Green熒光染料，每個(gè)上下游引物（濃度為10 μmol/L）各1 μL，稀釋后加入2 μL 的DNA 原液（初始濃度為2 μg），以及6 μL 的去離子水。PCR 反應(yīng)條件設(shè)置如下：首先進(jìn)行95 ℃的預(yù)變性步驟，時(shí)長(zhǎng)為10 min；然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的PCR 反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃的變性步驟（15 s），60 ℃的退火步驟（30 s），以及72 ℃的擴(kuò)增步驟（30 s）。在每個(gè)循環(huán)中同時(shí)讀取熒光數(shù)值。實(shí)驗(yàn)完成后，進(jìn)行熔解曲線分析。具體操作為：先進(jìn)行一次95 ℃、15 s的變性步驟，并在60 ℃下保持1 min，然后從60 ℃至95 ℃，每增加0.5 ℃讀取一次吸光值，最后再進(jìn)行一次95 ℃、15 s 的變性步驟，并讀取熒光數(shù)值。通過(guò)讀取Ct值，可以計(jì)算出ΔCt值（Ct目的基因-Ct 內(nèi)參GAPDH）、ΔΔCt 值（ΔΔCt 處理-ΔCt對(duì)照）和2-ΔΔCt值（相對(duì)表達(dá)量），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。熒光定量PCR引物見表1。

表1 引物序列表

2.3.4 Western blot檢測(cè)Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)

取出瘤組織稱質(zhì)量后放入玻璃勻漿器中，然后加入蛋白裂解液，將瘤組織樣本加入10 μL 的蛋白裂解液進(jìn)行操作。通過(guò)這一步驟，成功提取了腫瘤組織中的總蛋白。為了確定提取到的蛋白質(zhì)濃度，使用BCA法進(jìn)行濃度測(cè)定。隨后，采用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)對(duì)等量變性的蛋白樣品進(jìn)行分離。電泳過(guò)程中分別設(shè)置了80 V、30 min 和120 V、60 min 的電流條件，以確保蛋白質(zhì)在凝膠中得到充分分離。完成電泳后，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上。然后使用含有5%脫脂奶粉的TBS/T 緩沖液對(duì)轉(zhuǎn)膜后的膜進(jìn)行洗滌處理，搖床1.5 h。最后，將稀釋液稀釋的兔抗小鼠Caspase-3 抗體（1∶1 000）和VEGF 抗體（1∶500）分別加入處理后的膜中，孵育，4 ℃封閉過(guò)夜，用TBS/T 洗滌4 次，再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10 000），搖床1 h，倒掉二抗，TBS/T 洗滌4 次，加入顯影液于暗室中顯影。膠片蛋白質(zhì)條帶用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析。ImageJ軟件測(cè)定條帶灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.5 HE染色觀察各組肺組織病理變化

肺組織標(biāo)本用生理鹽水清洗后，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定，經(jīng)脫水、包埋后制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水洗，采用蘇木素染色液浸染1.5 min后充分水洗，1%鹽酸乙醇褪色20 s，自來(lái)水沖洗使切片恢復(fù)藍(lán)色，伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡10 min，中性樹膠封固，在20倍和200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的形態(tài)并拍照保存。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 和Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性后，應(yīng)用歸一化及單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜ 0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況比較

造模成功后給藥第4 天，模型組小鼠死亡1 只；給藥第6 天復(fù)方蟾酥膠囊低劑量組死亡1 只；給藥第11 天順鉑組死亡1 只、復(fù)方蟾酥膠囊低劑量組死亡2 只；給藥第13 天復(fù)方蟾酥膠囊中、高劑量組各死亡1 只。小鼠死亡前精神狀態(tài)差，全身顫抖，喘息樣呼吸，停止進(jìn)食和飲水。取材結(jié)束后每組取6 個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

3.2 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較

與模型組比較，復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組瘤重均顯著降低（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較

3.3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較

與模型組比較，復(fù)方蟾酥膠囊中、高劑量組及順鉑組能降低TNF-α 含量（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較（±s）

表3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

組別模型組順鉑組復(fù)方蟾酥膠囊低劑量組復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組復(fù)方蟾酥膠囊高劑量組TNF-α/（ng/L）542.12 ± 21.67 358.20 ± 41.49**446.85 ± 108.37 369.34 ± 14.85*372.86 ± 31.21*n6 6 6 6 6

3.4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA 表達(dá)情況比較

與模型組比較，復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組能顯著上調(diào)Caspase-3 mRNA 的表達(dá)（P＜ 0.05），顯著下調(diào)VEGF mRNA 的表達(dá)（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表達(dá)情況比較（±s）

注：與模型組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1。

組別模型組順鉑組復(fù)方蟾酥膠囊低劑量組復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組復(fù)方蟾酥膠囊高劑量組VEGF 1.00 ± 0.36 0.47 ± 0.08***1.17 ± 0.08 0.57 ± 0.15**0.99 ± 0.14 n 6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 ± 0.44 2.23 ± 0.30****0.76 ± 0.14 1.78 ± 0.16**1.06 ± 0.18

3.5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)情況比較

與模型組比較，順鉑組Caspase-3 蛋白的表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05），復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組Caspase-3蛋白的表達(dá)增高（P＜ 0.05）；復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組VEGF蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05），復(fù)方蟾酥膠囊低、高劑量組VEGF 蛋白的表達(dá)降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5、圖1。

表5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別模型組順鉑組復(fù)方蟾酥膠囊低劑量組復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組復(fù)方蟾酥膠囊高劑量組VEGF 1.00 0.47 ± 0.08***0.72 ± 0.20*0.55 ± 0.08**0.66 ± 0.09*n6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 1.94 ± 0.49**1.16 ± 0.28 1.79 ± 0.25*1.29 ± 0.23

圖1 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)電泳圖

3.6 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果

空白組小鼠肺臟組織無(wú)明顯異常，未見明顯的炎性改變。模型組肺組織中多見肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，局部支氣管可見上皮細(xì)胞壞死，核碎裂，有明顯肺水腫及出血。順鉑組及復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組肺組織中可見肺泡壁上有彌散的淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見大量支氣管上皮細(xì)胞增生，可見較大量的肺泡腔擴(kuò)張，肺水腫和出血情況大為減輕，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質(zhì)滲出。復(fù)方蟾酥膠囊低、高劑量組肺組織中可見較多肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，多見肺泡腔擴(kuò)張；少見支氣管上皮細(xì)胞壞死，核碎裂；局部組織邊緣可見肺水腫，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質(zhì)滲出，周圍有較多水腫液及紅細(xì)胞，但較模型組少。見圖2。

圖2 小鼠肺組織HE染色結(jié)果

4 討論

肺癌是最復(fù)雜的疾病之一，其潛在機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)中醫(yī)藥在肺癌的防治中發(fā)揮了很大作用，因此，進(jìn)一步探究中藥復(fù)方抑制肺癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及作用機(jī)制意義重大。

蟾酥具有確切的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還有逆轉(zhuǎn)耐藥性、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、阻滯細(xì)胞周期及增強(qiáng)免疫的作用［5］。炎癥反應(yīng)貫穿于腫瘤疾病的始終，TNF-α的增多能夠增強(qiáng)腫瘤免疫活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［6］。Caspase-3通過(guò)切割重要的細(xì)胞底物來(lái)執(zhí)行凋亡的下游執(zhí)行步驟，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞自噬死亡［7-9］。有實(shí)驗(yàn)證明VEGF 可以促進(jìn)血管活性分子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)血管張力，免疫抑制腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［10-14］。

本研究的復(fù)方蟾酥膠囊以蟾酥為君藥進(jìn)行組方，研究結(jié)果顯示，受藥物濃度增加藥物溶解度降低及蟾酥毒性增強(qiáng)影響，高劑量組藥效低于中劑量組；與模型組比較，復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組瘤質(zhì)量顯著降低，能有效的抑制Lewis 肺癌腫瘤的生長(zhǎng)。采用ELISA 法、PCR 與Western blot 檢測(cè)瘤組織中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF 的表達(dá)，均顯示復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組能降低TNF-α 含量，顯著上調(diào)Caspase-3 mRNA 及蛋白的表達(dá)，顯著下調(diào)VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)。肺組織HE結(jié)果顯示，與模型組比較，復(fù)方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組局部支氣管可見上皮細(xì)胞增生，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質(zhì)滲出。由此可見，復(fù)方蟾酥膠囊可以有效抑制Lewis肺癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，可能與上調(diào)Caspase-3的水平，下調(diào)TNFα、VEGF的表達(dá)有關(guān)。