鐘文雨，黃虹蓉，楊安然，孔怡然，林鐘石

(深圳市醫(yī)療器械檢測中心，廣東 深圳 518000)

0 引言

醫(yī)療器械是指單獨或者組合使用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品，也包括所需要的軟件[1]，其安全性與人民健康和社會安全都具有緊密聯(lián)系[2]。一次性醫(yī)療用品大多數(shù)由高分子聚合物即合成樹脂類制作而成[3]，合成樹脂具有許多優(yōu)異的性能，可以制造成塑料假肢、合成樹脂牙等[4]，被廣泛用于醫(yī)療的各個領(lǐng)域。市面上合成樹脂類一次性醫(yī)療用品種類越來越豐富，但也大大增加了其與人體暴露的風(fēng)險。因此，合成樹脂類材料的醫(yī)療器械的臨床前安全性評價就尤為重要，選擇適宜的檢測方法可以有效地縮短醫(yī)療器械的臨床前評價研究時限以及節(jié)省研究成本。體外細(xì)胞毒性試驗作為目前醫(yī)療器械進(jìn)行臨床前安全性評價的首選和必選試驗項目[5]，其具有研究周期短、敏感性高、節(jié)省經(jīng)費的優(yōu)勢[6]。其中的浸提液實驗是目前較為廣泛的用于檢測醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性的方法，其定量評價方法相對于定性評價方法更具有客觀性。

在GB/T 16886.5—2017 中體外細(xì)胞毒性試驗的定量評價方法包含中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法[7]。這四種試驗方法的機(jī)理存在不同之處，如何按照標(biāo)準(zhǔn)要求來選擇適宜的細(xì)胞毒性試驗方法，是目前醫(yī)療器械注冊前的一大難點。本實驗根據(jù)GB/T 16886.5—2017 附錄中提供的中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法四種定量試驗方法，選擇醫(yī)療領(lǐng)域中使用率較高的PE、PP、PS 和PVC 四種合成樹脂類材料作為代表，評價分析合成樹脂類材料在四種不同試驗方法下的細(xì)胞毒性結(jié)果的差異性，以此為選擇適宜的細(xì)胞毒性檢測方法提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 實驗材料與方法

樣品前處理參照GB/T 16886.12—2017，PE 材料、PP 材料、PS 材料和PVC 材料按照0.2 g/mL 的浸提比例制備樣品浸提液。

1.1 中性紅攝取法

1.1.1 材料

BALB/c 3T3 細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；DMEM 培養(yǎng)基、新生小牛血清(GIBCO)；乙醇、乙酸(廣州化學(xué)試劑廠)；中性紅染料(SIGMA)。

1.1.2 實驗步驟

將BALB/c 3T3 細(xì)胞按照1×104個細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對照溶液、陽性對照溶液、樣品浸提液。在培養(yǎng)24 h 后，小心棄去原培養(yǎng)液，用100 μL 預(yù)熱的PBS 沖洗后，每孔加入100 μL 的中性紅培養(yǎng)基再孵育3 h。然后棄去中性紅培養(yǎng)基，150 μL PBS沖洗后，每孔再加入150 μL 中性紅洗脫液，在酶標(biāo)儀540 nm 波長下測定吸光度并計算細(xì)胞相對活力。

1.2 集落形成法

1.2.1 材料

V79 細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；MEM 培養(yǎng)基、胎小牛血清(GIBCO)；吉姆薩染液(珠海貝索)。

1.2.2 實驗步驟

將V79 細(xì)胞按照100個細(xì)胞/13 mL 接種在6 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入2 mL 的空白對照溶液、陽性對照溶液、樣品浸提液。培養(yǎng)6 d 后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗后，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆薩染液染色后，計算每一孔的集落數(shù)目，并計算每個組別的PE 值。

1.3 MTT 比色法

1.3.1 材料

L-929 細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會 細(xì) 胞庫)；MEM 培 養(yǎng) 基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；

MTT(SIGMA)。

1.3.2 實驗步驟

將L929 細(xì)胞按照1×104個細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對照溶液、陰性對照浸提液、陽性對照、樣品浸提液，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無異常后，小心棄去原培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 的MTT 溶液再孵育2 h。然后棄去MTT 溶液，每孔加入100 μL 異丙醇，在酶標(biāo)儀570 nm 波長(參比波長650 nm)下測定光密度并計算存活率。

1.4 XTT 比色法

1.4.1 材料

L-929 細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì) 胞庫)；MEM 培 養(yǎng)基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；XTT、PMS(SIGMA)。

1.4.2 實驗步驟

將L929 細(xì)胞按照1×104個細(xì)胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)液，分別加入空白對照溶液、陰性對照浸提液、陽性對照以及樣品浸提液，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無異常后，每孔加入50 μL的XTT/PMS 溶液再孵育4 h。振蕩混勻后從每孔取出100 μL 等份液體至新的孔板對應(yīng)孔中，在酶標(biāo)儀450 nm波長(參比波長630 nm)下測定吸光度并計算存活率。

2 結(jié)果判定條件

以上四種不同定量試驗方法，均采用結(jié)果數(shù)值70%為界限判定樣品的細(xì)胞毒性。每種方法對應(yīng)的測定條件以及判定條件如表1 所示。

表1 不同方法的細(xì)胞毒性測定條件及判定

3 實驗結(jié)果

4 種不同的試驗樣品分別在四種定量試驗方法下測定細(xì)胞毒性，中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法的細(xì)胞毒性詳細(xì)結(jié)果如表2 所示。

表2 受試樣品在不同實驗方法下的細(xì)胞毒性結(jié)果

本實驗結(jié)果表明，合成樹脂類材料在這四種不同實驗方法下，表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性結(jié)果無顯著性差異，結(jié)果具有一致性。

4 討論

PE 是一種通過乙烯聚合制備得到的高性能樹脂，由于其優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性以及無味、無毒、植入體內(nèi)無不良影響等優(yōu)勢，低密度PE 可用于制造薄膜和包裝袋等；高密度PE 則用于制造人工臟器、人工關(guān)節(jié)、矯形外科修補(bǔ)材料等；超高分子量PE 在骨科和心血管植入領(lǐng)域得到普及[8]。PP 是丙烯聚合制備得到的材料，主要用于制造醫(yī)用導(dǎo)管、輸液容器等，也可經(jīng)表面活性劑處理后制成人工肺等[9]。PS 是苯乙烯單體自由基加聚合成而得到的透明、熱塑性合成樹脂[10]，主要用于制造醫(yī)療用瓶、注射器托盤和包裝材料等。PVC 是由氯乙烯在引發(fā)劑作用下聚合而成的熱塑性合成樹脂，具有良好的力學(xué)性能且耐寒、柔軟、透明[11]，主要用于輸血袋、輸液袋、體外循環(huán)裝置導(dǎo)管、鼓泡式氧合袋、尿袋等與人體短期接觸的制品。由此可見，合成樹脂在醫(yī)用耗材、治療性器械、植入性器械等多個方向都具有不可忽視的地位，因此其臨床前生物安全性評價是必不可少的。

通過細(xì)胞毒性定量檢測方法，可以客觀地測量細(xì)胞數(shù)量、蛋白質(zhì)總量、酶釋放、活體染料釋放以及還原等參數(shù)，其靈敏度和判定限都比定性評價更高，而且受到試驗者個人主觀因素的影響也更小。然而，定量的試驗方法中也各有優(yōu)勢和不足。中性紅攝取法是檢測溶酶體完整性，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、高通量的優(yōu)點[6]，但誘發(fā)溶酶體腫脹的物質(zhì)會干擾實驗結(jié)果而出現(xiàn)假陰性[12]；集落形成法通過細(xì)胞增殖能力表現(xiàn)細(xì)胞毒性，這種增殖能力在死細(xì)胞或不再具備分裂能力的細(xì)胞上是喪失的[13-14]，但受實驗操作人員的主觀因素影響較大且耗時長；MTT 和XTT 比色法實驗原理相同，都是通過降解活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶來反映細(xì)胞毒性[15]，但生成的有色物質(zhì)不同，MTT 比色法產(chǎn)生的甲臜需要通過裂解細(xì)胞以溶解測定，XTT比色法減少了人為操作誤差[16]，但XTT 試劑相較于MTT 成本較高，大大增加了試驗成本。

本試驗通過對PE、PP、PS、PVC 這四種材料進(jìn)行中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法測定細(xì)胞毒性，均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，因此這四種樹脂材料選擇任一定量測定方法均可測定。但在生產(chǎn)工藝過程中，原材料需要經(jīng)過一系列的切割、黏合等操作后才能成為最終產(chǎn)品，這些過程中也許會產(chǎn)生新的致使細(xì)胞毒性的物質(zhì)仍未可知。因而，在選擇細(xì)胞毒性的定量試驗方法時，仍然需要根據(jù)產(chǎn)品本身的特性選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。原材料的?xì)胞毒性雖然不能代表生產(chǎn)的最終產(chǎn)品的細(xì)胞毒性，但可以作為優(yōu)化產(chǎn)品的思路，節(jié)省產(chǎn)品研發(fā)成本。