梅紅， 汪炎， 洪文清， 宋立巖

（1.東華工程科技股份有限公司， 合肥 230024； 2.安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601）

污水處理廠（WWTP）一般聯(lián)合應(yīng)用物理、 化學(xué)和生物等多種處理方法有效去除污水中污染物。 在污染物分解過程中， 微生物進(jìn)行生物降解從而有效去除污染物［1-2］。 病毒是一種專門寄生在細(xì)胞內(nèi)的微生物， 它依靠宿主微生物來生存和復(fù)制［3］。 在感染周期中， 病毒通過裂解微生物細(xì)胞來釋放宿主提供的營養(yǎng)物質(zhì)， 以及通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)病毒基因，重新編程被感染宿主的代謝過程， 從而完成自身的繁殖［4-5］。 同時， 細(xì)菌群落作為病毒寄生最多的宿主微生物， 其活動和功能受到病毒的直接調(diào)控［4］。環(huán)境中病毒的數(shù)量通常比微生物數(shù)量多10 倍以上，并通過侵染微生物對其群落結(jié)果和功能產(chǎn)生直接影響， 間接地對污水處理效果產(chǎn)生顯著影響［6-7］。

隨著宏基因組技術(shù)的快速發(fā)展， 人們對于病毒群落的組成和多樣性有了更深入的理解［8］。 同時，生物信息分析可以進(jìn)一步解析病毒群落在環(huán)境介質(zhì)中的演化， 例如線性判別LEfSe 分析可以深入分析不同組間顯著差異的群落特征， 并且已被用作揭示河流、 湖泊和海洋等不同環(huán)境中差異微生物群落的工具［9-11］。 這些研究揭示了不同生境中代表性微生物并闡明了差異微生物的主要特征和功能。 然而，在WWTP 各子系統(tǒng)中差異病毒群落發(fā)揮何種功能仍鮮為人知。

病毒通過侵染宿主微生物從而對宿主微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生直接影響， 并間接對污水處理效果產(chǎn)生顯著影響， 因此， 研究WWTP 中病毒群落的特征， 及其與宿主的關(guān)聯(lián)可以為提升WWTP 的污水處理效率提供科學(xué)依據(jù)。 本文以安徽省某化工園區(qū)綜合廢水處理核心單元為研究對象， 采用宏基因組測序和LEfSe 分析， 研究了該WWTP 中原水、厭氧池和污泥池中病毒群落的分布特征及其與細(xì)菌群落的相互關(guān)系， 闡明WWTP 各子系統(tǒng)中病毒群落分布格局， WWTP 中細(xì)菌群落多樣性與病毒群落組成間的關(guān)系， 以及WWTP 各子系統(tǒng)中病毒群落的差異， 旨在通過調(diào)查研究結(jié)合生物信息學(xué)分析， 揭示W(wǎng)WTP 中病毒群落的分布特征， 明晰宿主（細(xì)菌）對病毒群落組成的重要影響作用。 弄清WWTP 中病毒群落分布格局及其發(fā)生機制， 這不僅有助于闡明病毒在污水中的分布和遷移規(guī)律， 拓展環(huán)境微生物學(xué)研究范疇， 而且對我國水資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 采樣點信息和樣品采集

試驗研究在安徽省某化工園區(qū)綜合廢水處理廠（WWTP）內(nèi)進(jìn)行， 該WWTP 的日處理水量為1.5 萬t。 WWTP 的工藝流程如圖1 所示， 廢水經(jīng)澄清池混凝沉淀后進(jìn)入緩沖池， 出水進(jìn)入水解池使其可生化性得以改善， 然后經(jīng)厭氧池厭氧處理后流入好氧生物池進(jìn)行好氧處理， 最后經(jīng)過二沉池沉淀后排放。

圖1 WWTP 工藝流程Fig.1 Process flow of WWTP

從WWTP 的進(jìn)水處（RW）、 厭氧池（IAT）和回流的活性污泥（AS）中分別平行采集了3 份500 mL樣品置于滅菌的超凈HDPE 瓶中， 樣品置于冰上運回實驗室， 并在8 h 內(nèi)完成預(yù)處理， 采用0.22 μm無菌親水膜過濾水樣， 同時以5 000 r／min 離心污泥樣品20 min 并取0.1 g 濃縮污泥。 預(yù)處理后的樣品用于DNA 提取。

1.2 理化指標(biāo)的測定

使用YSI 6600 V2 多參數(shù)水質(zhì)分析儀測量水樣的pH 值， 按標(biāo)準(zhǔn)方法測定水樣的COD、 NH3-N、TN 和TP［12］。

1.3 DNA 提取與宏基因組測序

使用FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals， Irvine，CA）提取DNA， 并用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific， USA）定量， 然后用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測［13］。 利用Covaris M220 將DNA 片段化到約400 bp， 最后利用NEXTFLEXTMRapid DNA-Seq Kit 構(gòu)建PE 文庫。 配對端測序在上海某公司的Illumina HiSeq4000 平臺上進(jìn)行。

1.4 宏基因組序列數(shù)據(jù)的處理

首先對原始序列進(jìn)行拆分、 質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理， 質(zhì)控在Fastp v0.20.0 上進(jìn)行； 然后使用優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝和基因預(yù)測， 對得到的基因進(jìn)行物種和功能上的注釋以及分類， 注釋包括基因物種注釋NR。 病毒的豐度以NR 物種注釋后RPKM 標(biāo)準(zhǔn)化后的絕對豐度表示， 即每百萬條序列中， 每個基因以1 000 個堿基為單位， 比對上的reads 條數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

基于r 3.6.3 和RStudio 1.1.463 軟件， 并利用Spearman 相關(guān)性分析檢驗細(xì)菌群落豐富度和多樣性與病毒群落相異度的相關(guān)性。 通過線性判別（LEfSe）分析甄別了各樣點間的差異病毒， 同時基于非參數(shù)Kruskal-Wallis 秩和檢驗與Wilcoxon 秩和檢驗判別了差異病毒的一致性。 在LEfSe 分析中，選定log10（LDA）的值為3.6。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的總體消減特征

COD、 TN 和NH3-N 的濃度 在 經(jīng) 過WWTP 的子系統(tǒng)運行后得到了有效控制， 各子系統(tǒng)中污染物濃度存在顯著性差異（P ＜0.05）， 同時由于TP 進(jìn)水濃度較低， 故濃度變化并不規(guī)律（表1）。

表1 WWTP 研究單元的水質(zhì)指標(biāo)Tab.1 Water quality indicators in research unit of WWTP

WWTP 中各流程病毒豐度如下： 原水124 680±8 112、 厭氧池87 585±11 928、 活性污泥136 988±15 514。 當(dāng)廢水經(jīng)水解和厭氧處理后， 厭氧池中病毒濃度相較于進(jìn)水處下降了29.75%（以均值計算），表明厭氧處理對病毒的去除有一定作用； 污泥池中病毒濃度相較進(jìn)水處上升了9.87%， 這是因為活性污泥富集了大量微生物成為病毒適宜的宿主。

2.2 病毒群落分布特征

基于宏基因組技術(shù)， 本研究在病毒門水平上展示了各樣點中相對豐度為1% 以上的病毒（圖2），通過熱圖展示了相對豐度前50 的病毒屬（圖3）。WWTP 中主要病毒門包含Uroviricota 和Nucleocytoviricota 門， 其在各樣點平均占比為53.42% 和26.10%， 其中Uroviricota 門在活性污泥的樣本中占比68.98%， 而Nucleocytoviricota 門在原水中占比52.59%。 Uroviricota 門可能會影響人體的新陳代謝或免疫系統(tǒng)［14］， 而Nucleocytoviricota 門由于其特殊的構(gòu)造而只能侵染環(huán)境中的真核生物［15］， 同時真核生物會分泌大量干擾素應(yīng)對病毒的侵染， 但干擾素會對人類的生命健康產(chǎn)生多重影響和作用［16-17］。

圖2 病毒群落在門水平上的組成Fig.2 Viral community composition at phylum level

圖3 病毒群落在屬水平上的組成Fig.3 Composition of viral communities on genus level

在病毒的屬水平上， 各病毒在不同樣點中的分布存在差異。 具體而言， 原水中的Kembevirus、Krylovvirus 和Phikzvirus 屬占比較高， 且在后續(xù)流程中相對豐度明顯下降； 厭氧池中相對豐度較高的病毒并不多， 僅Hokovirus 屬最顯著， 這可能是因為厭氧環(huán)境中產(chǎn)生能量的途徑急劇減少， 限制了病毒增殖和感染宿主［18］， 同時這解釋了厭氧池中病毒豐度下降了29.75%， 而在活性污泥中Phabquatrovirus、Lightbulbvirus、 Obolenskvirus 和Lanavirus 等病毒屬得到了富集（圖3）。 研究結(jié)果表明活性污泥中微生物濃度較高， 改變了物種間的競爭關(guān)系， 導(dǎo)致病毒的寄主細(xì)胞數(shù)量增加， 從而促進(jìn)了病毒的增殖。

2.3 病毒在各單元中的差異

通過LEfSe 分析對比原水、 厭氧池和活性污泥三者中的差異病毒， 并將log10（LDA）的值設(shè)置為3.6， 結(jié)果表明， Megaviricetes 綱、 Mimiviridae 科、Myoviridae 科和Mimivirus 屬是原水中差異顯著的病毒。 Hokovirus 屬、 Caudoviricetes 綱、 Caudovirales目和Siphoviridae 科是活性污泥中差異顯著的病毒（圖4）。 原水中多數(shù)差異病毒均與肺炎病毒相關(guān)，以往研究認(rèn)為Mimiviridae 科、 Myoviridae 科和Mimivirus 屬可能會引起嚴(yán)重的肺炎［19］。 相對而言，活性污泥中的差異病毒繁多， 如Hokovirus 屬是一種豬病毒， 而Siphoviridae 科是感染金黃色葡萄球菌的病毒［20-21］。 總之， 三者間的差異病毒的功能和感染的對象均不同， 表明WWTP 中的病毒群落分布具有空間異質(zhì)性。 病毒通過侵染特定的宿主微生物進(jìn)行繁殖， 宿主微生物的組成會直接影響病毒的種類， 因此， 本研究中WWTP 的病毒群落分布空間異質(zhì)性主要是由于各處理單元宿主微生物種類不同而導(dǎo)致的。 探究不同處理單元中病毒的分布特征可以了解各單元的宿主微生物的組成， 從而可以評估各單元的生物處置效能。

圖4 基于LEfSe 分析的原水、 厭氧池和活性污泥三者間的差異病毒Fig.4 Differential virus among raw water, anaerobic tanks, and activated sludge based on LEfSe analysis

2.4 病毒群落與細(xì)菌群落間的關(guān)系

基于Mantel 檢驗并利用Spearman 相關(guān)性分析， 檢驗了WWTP 中細(xì)菌群落多樣性和豐富度與病毒群落的Bray-Curtis 相異度之間的關(guān)系。 Bray-Curtis 相異度可以衡量樣本中不同物種組成的數(shù)量特征［22］。 在WWTP 中， 隨著細(xì)菌群落的豐富度和多樣性增加， 各樣點中病毒群落越來越相似（圖5）， 尤其是細(xì)菌群落豐富度與病毒相異性之間的關(guān)系更顯著（P=0.000 2， R=0.942）。 當(dāng)細(xì)菌群落豐富度和多樣性增加時， 可能會為病毒提供更多的生態(tài)位， 進(jìn)而增加病毒數(shù)量， 并使得各樣點間病毒組成越來越相似。 另一方面， 細(xì)菌群落豐富度和多樣性的增加會使得菌落內(nèi)部競爭加劇， 促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生更多抗病毒機制， 這將導(dǎo)致某些病毒消失， 從而使各樣點間病毒群落越來越相似。 綜上， 細(xì)菌群落豐富度和多樣性的增加導(dǎo)致病毒群落的相似性增加， 這是宿主選擇、 競爭和進(jìn)化等因素綜合作用的結(jié)果。 通過分析細(xì)菌群落α 多樣性與病毒間的相關(guān)性， 闡明了污水處理過程中病毒群落增殖可能受到宿主（細(xì)菌）多樣性調(diào)控， 這為污水處理過程的優(yōu)化提供了一個新的視角， 如何減緩甚至阻斷病毒利用WWTP 中宿主增殖是未來的重要研究課題。

圖5 細(xì)菌群落豐富度和多樣性對病毒群落的相關(guān)性Fig.5 Correlation of bacterial community richness and diversity with viral communities

3 結(jié)論

通過宏基因組測序技術(shù)并結(jié)合LEfSe 差異分析， 對WWTP 核心單元中病毒群落的分布格局、 差異病毒群落和病毒-細(xì)菌間的相關(guān)性進(jìn)行了深入討論。 研究結(jié)果表明WWTP 中病毒群落分布具有空間異質(zhì)性， 并廣泛存在對人體或環(huán)境具有危害的病毒群落； 厭氧池的環(huán)境會限制病毒增殖和感染宿主，而活性污泥中數(shù)量眾多的微生物會促進(jìn)病毒群落的增殖； 病毒群落的相似性會隨著細(xì)菌群落豐富度（P ＜0.05）的增加而增加， 表明病毒對宿主微生物具有直接調(diào)控作用以及對污水生物降解效能的間接調(diào)控。 本研究為WWTP 中病毒生態(tài)學(xué)提供了新的視角， 為污水處理效能的提升提供了科學(xué)依據(jù)。