段妔 李林艷 萬雪 余江 徐敏 鄭藝 范振海 余麗梅

生育缺陷給社會與家庭帶來極大的困擾及非常沉重的經(jīng)濟負擔，尤其是國家施行二孩及三孩政策放開以來，高齡孕婦明顯增多，生育風(fēng)險增大。因此，人們對優(yōu)生優(yōu)育質(zhì)量及產(chǎn)前篩查意識不斷增強，產(chǎn)前診斷受益人群隨之擴大[1-2]。如何進行有效的產(chǎn)前篩查，降低出生缺陷，已成為國家、社會及家庭關(guān)注的重點?，F(xiàn)階段，擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)（noninvasive prenatal testing-plus，NIPT-plus）在高危孕婦人群產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究，是當前基于高通量測序檢測的一項產(chǎn)前篩查新技術(shù)，也是對孕婦母體外周血漿中的胎兒游離DNA 進行測序來檢測胎兒21- 三體、18- 三體、13- 三體染色體非整倍體異常以及亞顯微結(jié)構(gòu)異常（微缺失/ 微重復(fù)）所致胎兒生長發(fā)育畸形、器官功能障礙及智力低下或殘疾等缺陷的有效手段[3-4]。它可有效篩查高危孕婦產(chǎn)前胎兒染色體異常疾病的風(fēng)險，提高優(yōu)生優(yōu)育質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2021 年1 月—2022 年12 月就診于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心的5 085 例孕婦，觀察指標包括高齡孕婦≥35 歲、 B 超提示異常信息、產(chǎn)前篩查血清學(xué)存在高風(fēng)險。經(jīng)孕婦自愿同意后接受 NIPT-plus 檢測技術(shù)，對陽性結(jié)果的孕婦采取羊水細胞穿刺術(shù)檢測，分析染色體異常因素。（1）納入標準：自然受孕、單胎、妊娠期滿13 ～24 周，明確產(chǎn)前篩查指征：①高危孕婦年齡；②孕婦血清學(xué)高風(fēng)險篩查；③超聲影像學(xué)異常指標篩查；④孕婦不良孕產(chǎn)史等。（2）排除標準：非自然受孕、多胎、有傳染病史（如肝炎、結(jié)核、HIV 陽性等）、惡性腫瘤、近期有先兆流產(chǎn)征象或在1個月內(nèi)接受過外源DNA 的免疫治療，以及孕婦在1 年內(nèi)有輸血史等其他侵入性產(chǎn)前診斷禁忌證。（3）臨床資料的收集：①建立遺傳咨詢病例登記；②查閱遺傳咨詢孕婦的相關(guān)檢查資料；③詳細記錄高危孕婦的年齡、胎齡、孕產(chǎn)史、家族史、不良接觸史、產(chǎn)前篩查項目及超聲篩查結(jié)果等。（4）檢測流程：抽取孕婦外周血10 mL 左右，對血漿中胎兒游離DNA 進行測序，檢測13，18，21 三體及性染色體異常等指標。經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準檢測陽性樣本，父母溯源外周血染色體核型分析。

1.2 方法

1.2.1 孕婦血漿提取

EDTA 采血管采集孕婦靜脈血10 mL 左右。1 600 rpm離心10 min；小心吸取表層血漿于EP 管中，16 000 rpm 離心10 min，沉淀備用。

1.2.2 胎兒游離DNA 提取

參照QIAampDNA Blood mini kit 試劑盒說明書進行血漿DNA 提取操作。

1.2.3 NIPT-plus 檢測

在 BGISEQ-500 測序平臺采用胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定連接測序法）進行全基因組大規(guī)模平行測序。

1.2.4 培養(yǎng)羊水細胞

羊膜腔穿刺術(shù)必須確保安全無菌，在B 超引導(dǎo)下進行操作。抽取羊水約20 mL，分別裝入2 個10 mL的無菌塑料離心管中，1 500 rpm 離心10 min。在超凈工作臺中進行去上清液操作，保留約0.5 mL 羊水；與沉淀混勻后接種于2 個細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)7 ～10 d，觀察得到分裂中期的細胞。收獲前1 h 用秋水仙素處理，再經(jīng)過低滲、固定、滴片、胰酶消化、G 顯帶等一系列實驗操作制備染色體。

1.2.5 羊水細胞染色體核型分析

正常核型：每張玻片計數(shù)核型30 個，并對其中顯帶清楚、形態(tài)良好的5 個分裂相進行分析。

異常核型：根據(jù)異常核型種類的不同，核型計數(shù)增加至50 ～100 個。核型分析數(shù)量也相應(yīng)增加，有必要的情況下還需加做 N 顯帶或C 顯帶進行分析，以確定染色體結(jié)構(gòu)異常及其多態(tài)性。

1.3 觀察指標

（1）NIPT-plus 結(jié)果提示染色體數(shù)目異常的高風(fēng)險病例，如經(jīng)羊水細胞染色體核型分析未見相應(yīng)染色體數(shù)目異常，則提示NIPT-plus 結(jié)果為假陽性。

（2）NIPT-plus 結(jié)果提示染色體結(jié)構(gòu)異常的高風(fēng)險病例，如經(jīng)羊水細胞染色體核型分析，且有必要的情況下加做特殊染色體顯帶，均未見相應(yīng)染色體結(jié)構(gòu)異常，則提示NIPT-plus 結(jié)果為假陽性。

（3）本研究分析異常核型均參照《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN）2020》標準進行描述[5-7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料用n（%）表示，計量資料用（±s）表示。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 病例基本情況

本研究總共病例數(shù)為5 0 8 5 例，年齡3 5 ～5 0歲，平均（3 7±2）歲，其中3 5 ～4 5 歲年齡段為5 0 0 0 例，＞4 5 歲年齡段為8 5 例。納入時平均孕周（1 6.0±2.0）周。

2.2 NIPT-plus 檢測結(jié)果及陽性預(yù)測指標

共檢測5 085 例患者中，共篩出51 例高風(fēng)險病例，其中8 例21- 三體、9 例18- 三體、1 例13- 三體、14 例性染色體、19 例其他染色體異常。51 例異常病例均行羊膜腔穿刺檢測結(jié)果證實有21 例確診異常，其中有7 例21- 三體（陽性87.50%）、2 例18-三體（陽性率22.22%）、8 例性染色體異常（陽性率57.14%）、其他染色體異常4 例（陽性率21.05%），見表1。

表1 NIPT-plus 對高齡孕婦產(chǎn)前篩查胎兒染色體異常的結(jié)果

2.3 染色體 G 顯帶核型檢測結(jié)果分析

5 085 例孕婦中，共篩出51 例異常病例，行羊膜腔穿刺術(shù)之后檢測結(jié)果證實存在21 例確診異常，見表2。其中21 例中涉及臨床常見染色體非整倍體異常13 例，分別為染色體核型是47，XN，+21 者7 例、染色體核型是47，XN，+18 者2 例，染色體核型是47，XXY者4 例，異常占比分別為0.14%、0.04%，0.08%。47，XN，+21、47，XN，+18、47，XXY 異常染色體核型見圖1 ～圖6。

圖1 箭頭標注區(qū)為原圖異常染色體

圖2 47，XN，+21

圖3 箭頭標注區(qū)為原圖異常染色體

圖4 47，XN，+18

圖5 箭頭標注區(qū)為原圖異常染色體

圖6 47，XXY

表2 13 例染色體數(shù)目異常核型結(jié)果

3 討論

隨著我國人口老齡化進程的不斷發(fā)展，為優(yōu)化我國人口比例，國家先后出臺了開放二胎、三胎的生育政策。近年來，有些城市更是提出了鼓勵一對夫婦生育三胎的政策優(yōu)惠措施，鼓勵適齡女性提升生育率[8-9]。因此，高齡孕產(chǎn)婦明顯增多，由染色體異常所導(dǎo)致的生育缺陷風(fēng)險也隨之增多，孕前健康體檢、產(chǎn)前染色體疾病健康篩查顯得尤為重要。針對這些高危孕婦進行無創(chuàng)基因產(chǎn)前篩查和染色體產(chǎn)前診斷可有效降低生育缺陷的風(fēng)險?，F(xiàn)階段，我國通常采用新一代高通量測序技術(shù)用于孕婦外周血胎兒游離DNA 的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查，該技術(shù)具有早期發(fā)現(xiàn)、無創(chuàng)、安全、準確、規(guī)范、便捷、快速、成本低等優(yōu)勢，在臨床應(yīng)用中越來越廣泛[10-11]。近年來，采用NIPTplus 對常見的21- 三體綜合征、18- 三體綜合征和13-三體綜合征的篩查準確性得到一致認同[12-13]。然而，在臨床實踐中仍舊不斷出現(xiàn)NIPT-plus 檢測假陰性及假陽性的結(jié)果。本研究共篩查5 085 例患者中，篩出51 例NIPT-plus 檢測高風(fēng)險病例，完全涵蓋了染色體異常分類中的染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。當然，主要包括臨床常見的染色體非整倍體異常以及亞顯微結(jié)構(gòu)的缺失或重復(fù)異常，這其中有8 例21-三體、9 例18-三體、1 例13-三體、14 例性染色體、19 例其他染色體異常；對51例NIPT-plus 檢測高風(fēng)險病例均行羊水細胞染色體核型分析，結(jié)果證實存在21 例病例異常，其中有7 例21-三體異常（陽性率為87.50%）、2 例18- 三體異常（陽性率為22.22%）、8 例性染色體異常（陽性率為57.14%）、其他染色體異常4 例（陽性率為21.05%）。

從本研究結(jié)果來看，NIPT-plus 在檢測技術(shù)層面與羊膜腔穿刺染色體核型分析檢測結(jié)果存在差異，原因分析可能與下列因素相關(guān)：（1）NIPT-plus 檢測過程中存在極大的可能性被孕婦自身異常的 DNA 干擾，從而導(dǎo)致無創(chuàng)結(jié)果與核型分析結(jié)果不相符[14-16]。（2）可能導(dǎo)致 NIPT-plus 檢測結(jié)果出現(xiàn)性染色體非整倍體高風(fēng)險異常的因素有以下幾種[17]，如性染色體互換、母體染色體嵌合、限制性胎盤嵌合、胎盤滋養(yǎng)層細胞等因素。因此，針對NIPT-plus 檢測結(jié)果提示性染色體異常的高風(fēng)險病例，進一步進行羊膜腔穿刺術(shù)，并對羊水標本采用染色體核型分析、熒光原位雜交、分子核型分析等其他染色體及分子檢測技術(shù)，對于確診異常病例具有非常重要的意義[19-20]。雖然臨床醫(yī)師對于NIPTplus 的準確性和無創(chuàng)性普遍認可，但也存在假陽性病例的概率。因此，臨床上建議NIPT-plus 可作為高風(fēng)險孕婦產(chǎn)前篩查的技術(shù)手段，必要時需聯(lián)合羊膜腔穿刺進行羊水細胞染色體核型分析進一步確診。

綜上所述，NIPT-plus 作為 NIPT 的升級版，是檢測胎兒13、18、21 染色體非整倍體異常以及亞顯微結(jié)構(gòu)異常（微缺失/微重復(fù)）所致胎兒生長發(fā)育畸形、器官功能障礙及智力低下或殘疾等缺陷的有效手段[20-21]。該技術(shù)在高危孕婦產(chǎn)前篩查中對胎兒染色體異常風(fēng)險的診斷與鑒別診斷具有重要意義，其研究結(jié)果可為產(chǎn)前診斷后期標準制定提供借鑒內(nèi)容。