瞿穎，向科旭，王蓓茹，侯鋮宇，王繼勇

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院，湖南 懷化 418000 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

食管癌是全球性的常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率分別占至惡性腫瘤第7 位及第6 位[1]。當(dāng)前，食管癌主要采用手術(shù)、放化療、免疫和靶向治療等聯(lián)合治療方案。其中手術(shù)仍然是首選治療，但是食管癌發(fā)現(xiàn)時(shí)往往是局部晚期，手術(shù)切除局部腫瘤后，局部失敗率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率很高，故而術(shù)前常進(jìn)行新輔助治療（放療、化療或聯(lián)合治療），能夠減少腫瘤微轉(zhuǎn)移、提高完全切除率。目前本科室針對(duì)局部晚期食管癌患者術(shù)前主要采用化療加免疫治療（卡鉑+白蛋白紫杉醇+卡瑞麗珠單抗），待病灶縮小后行手術(shù)治療，該方式治療效果良好，部分患者可以達(dá)到病理完全緩解[2]。但是，輔助治療后患者往往出現(xiàn)氣血不足的表現(xiàn)，出現(xiàn)貧血、白細(xì)胞降低等相關(guān)并發(fā)癥，從而影響食管癌治療效果。由于食管癌手術(shù)范圍大（切除全部食管以及部分胃），手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，中醫(yī)認(rèn)為手術(shù)、長(zhǎng)時(shí)間麻醉會(huì)耗傷人體氣血，故而食管癌術(shù)后往往氣血不足[3]，且部分患者行化學(xué)治療后，常出現(xiàn)骨髓抑制，中醫(yī)認(rèn)為化療后骨髓抑制基本屬于氣血不足[4]，術(shù)后還會(huì)繼續(xù)行一定療程的化學(xué)輔助治療，往往會(huì)損傷脾胃，加之食管癌患者脾胃本不足，氣血生化無源，更加耗傷人體氣血，故而在治療食管癌期間注重恢復(fù)氣血。八珍湯為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典方劑，本科室在臨床上運(yùn)用八珍湯聯(lián)合化療加免疫治療方式能夠減少血液系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，有效改善患者氣血不足的表現(xiàn)。故探討食管癌氣血不足證的治療及機(jī)制研究尤為重要。文獻(xiàn)表明，八珍湯輔助放化療治療惡性腫瘤可取得滿意的療效[5-7]。其在改善患者營(yíng)養(yǎng)狀況、增強(qiáng)免疫功能、提高生活質(zhì)量以及延長(zhǎng)生存期等方面發(fā)揮著重要的作用[8-9]。有研究表明，八珍湯聯(lián)合放化療可激活CD4、CD8、NK 細(xì)胞活性，增強(qiáng)中晚期食管癌患者的免疫功能，同時(shí)減輕放化療引起的骨髓抑制等不良反應(yīng)，從而提高抗腫瘤作用[10]。也有研究報(bào)道術(shù)前同步放化療聯(lián)合八珍湯治療食管癌獲得良好的療效[11]。雖然八珍湯在食管癌治療方面發(fā)揮重要作用，但是其具體機(jī)制尚不清楚。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的土壤，中藥干預(yù)腫瘤微環(huán)境已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥抗腫瘤的優(yōu)勢(shì)不在于徹底消滅腫瘤，在于重塑腫瘤微環(huán)境，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的增殖、血管生成、免疫逃逸等[12]。腫瘤微環(huán)境的理論基礎(chǔ)與中醫(yī)整體觀念一致，不單純研究腫瘤本身，還探索腫瘤周圍環(huán)境對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。故而基于腫瘤微環(huán)境探索八珍湯重塑腫瘤微環(huán)境的機(jī)制更能闡釋八珍湯的作用機(jī)制與辨病辨證施治。生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從生物網(wǎng)絡(luò)出發(fā)分析藥物有效成分與疾病和靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，進(jìn)而闡明藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的潛在靶點(diǎn)與作用機(jī)制，并借助分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 篩選藥物有效成分及靶點(diǎn)通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，分別根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)檢索八珍湯中各個(gè)中藥（人參、白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎）的活性成分。篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。利用TCMSP 獲取八珍湯活性成分的靶標(biāo)蛋白，根據(jù)UniProt（http：//www.uniport.org/）數(shù)據(jù)庫中蛋白注釋文件將靶蛋白的名稱轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 獲取影響食管癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)靶點(diǎn)通過R 語言中的TCGAbiolinks 包（版本2.25.3）從美國(guó)國(guó)家癌癥研究所建立的癌癥基因組圖譜（TCGA，https：//portal.gdc.cancer：gov）數(shù)據(jù)庫下載食管癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)格式為FPKM，從原始數(shù)據(jù)中篩選具有完整預(yù)后信息的食管癌樣本，對(duì)于食管癌樣本基因表達(dá)矩陣重復(fù)數(shù)據(jù)保留表達(dá)值最高的數(shù)值。通過使用R 語言的ESTIMATE 包（版本1.0.13）計(jì)算食管癌腫瘤樣本的相關(guān)評(píng)分。使用survminer 包的surv_cutpoint 函數(shù)確定各相關(guān)評(píng)分生存曲線的最佳截?cái)嘀担╟ut-off 值），并根據(jù)cut-off 值將腫瘤樣本分為高低評(píng)分兩組，并利用survival包（版本3.5-0）和survminer 包（版本0.4.9）分析高低分組間的生存率，繪制相應(yīng)的生存曲線，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)上述高低分組生存分析結(jié)果，使用R 軟件的limma 包（版本3.54.1）篩選與食管癌患者生存顯著相關(guān)的免疫評(píng)分高低組和基質(zhì)評(píng)分高低組間的差異表達(dá)基因并取并集。篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|＞0.585 和校正后的P＜0.05。并集中的差異基因是食管癌腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)基因，將這些預(yù)后相關(guān)基因作為重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)基因。

1.3 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的靶點(diǎn)篩選及“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用在線工具Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)上述八珍湯有效成分靶點(diǎn)及重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因取交集，獲得交集基因。結(jié)合藥物成分信息文件，使用Cytoscpe 3.9.1 構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物信息學(xué)分析采用生物學(xué)富集方法對(duì)上述過程得到的交集基因進(jìn)行分析，本過程采用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）完成，從基因本體（GO）富集分析以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集兩方面對(duì)共有基因進(jìn)行分析，并通過三線表呈現(xiàn)，篩選條件：FDR＜0.05。

1.5 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub 基因篩選將八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫獲得其PPI 網(wǎng)絡(luò)映射關(guān)系，并通過Cytoscape 3.9.1 對(duì)該映射關(guān)系進(jìn)行可視化，并利用Cytoscape 的插件CytoHubba 篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，根據(jù)最大團(tuán)中心（MCC）算法篩選最為重要的前5 個(gè)Hub 基因，并將這5 個(gè)Hub 基因作為核心基因。

1.6 分子對(duì)接將PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的核心基因作為后續(xù)分析的核心靶點(diǎn)，檢索核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥物成分作為核心藥物成分。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心藥物成分的3D 結(jié)構(gòu)，下載其SDF 格式文件，并通過OpenBabelGUI 將其轉(zhuǎn)換成mol2 格式文件。在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)并應(yīng)用Pymol 軟件去溶劑分子、水分子及配體，保存為pdb 格式文件，其中靶蛋白的選擇標(biāo)準(zhǔn)為來源于人蛋白且具有高分辨率。將受體蛋白文件和藥物配體文件分別導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件加全氫、分配電荷、檢測(cè)和設(shè)置扭轉(zhuǎn)鍵，并保存為pdbqt 格式文件。將受體蛋白和藥物配體的pdbqt 格式文件導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件生成對(duì)接盒子并保存為gpf 格式文件，然后運(yùn)行autogrid 計(jì)算格點(diǎn)中相關(guān)能量，該數(shù)據(jù)保存為GLG 文件。使用半柔性對(duì)接方式進(jìn)行對(duì)接，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，并運(yùn)行autodock，結(jié)果文件為GLG 文件，該文件記錄了50 種對(duì)接結(jié)果的結(jié)合自由能等信息，下載結(jié)合自由能最低的一種對(duì)接方式通過Pymol 繪制模型圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分及靶蛋白獲取通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，共獲得八珍湯組方藥物150 個(gè)有效成分，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫匹配基因名成功的有效成分有123 個(gè)，其中當(dāng)歸藥物成分2 個(gè)、川芎藥物成分6 個(gè)、熟地黃藥物成分2 個(gè)、白芍藥物成分8 個(gè)、白術(shù)藥物成分4 個(gè)、茯苓藥物成分6 個(gè)、甘草藥物成分88 個(gè)、人參藥物成分17 個(gè)，其中重復(fù)成分有5 個(gè)。基于上述有效成分，經(jīng)過篩查和注釋后獲得239 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 不同評(píng)分分組與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系見圖1。通過TCGA 數(shù)據(jù)庫下載食管癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，經(jīng)過篩選得到具有完整臨床預(yù)后信息的食管癌樣本151 例。根據(jù)食管癌樣本的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的cut-off 值進(jìn)行分組，高于cut-off 值的樣本歸為高分組，低于cut-off 值的樣本歸為低分組。免疫評(píng)分最佳cut-off 值為219.2，共96 例樣本分入高分組，另55 例樣本屬于低分組?；|(zhì)評(píng)分的最佳cut-off 值為-1 164.9，同樣133 例和18 例樣本分別歸入高分組和低分組。綜合評(píng)分的cut-off 值為-663.3，同樣112 例和39 例樣本分別歸入高分組和低分組。采用Kaplan-Meier 法分析高低分組間的生存概率，并繪制生存曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高評(píng)分組較低評(píng)分組預(yù)后差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明腫瘤微環(huán)境中的免疫成分和基質(zhì)成分共同影響著食管癌患者的預(yù)后。

圖1 不同評(píng)分分組生存曲線

2.3 食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)差異基因篩選見圖2。通過對(duì)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分不同分組間的生存分析發(fā)現(xiàn)，評(píng)分高組較評(píng)分低組預(yù)后差，差異顯著，為探索重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)靶點(diǎn)，分別根據(jù)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分進(jìn)行高低分組，并通過limma 包篩選它們的差異基因，結(jié)果如下：根據(jù)基質(zhì)評(píng)分分組篩選到1 096 個(gè)上調(diào)基因，488 個(gè)下調(diào)基因；根據(jù)免疫評(píng)分分組篩選到770 個(gè)上調(diào)基因，117 個(gè)下調(diào)基因；篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2FC|＞1，F(xiàn)DR＜0.05。分別將上調(diào)和下調(diào)基因以及前40 個(gè)差異基因通過火山圖和熱圖進(jìn)行可視化展現(xiàn)。最后通過將基質(zhì)評(píng)分分組及免疫評(píng)分分組的差異基因取并集，去除重復(fù)基因，共獲得1 373 個(gè)差異基因作為重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的主要靶點(diǎn)。

2.4 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)藥物靶點(diǎn)獲取見圖3。通過上述差異分析獲得食管癌腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)基因1 373 個(gè)。將上述基因與239 個(gè)八珍湯有效成分靶基因取交集，得到八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)藥物靶點(diǎn)31 個(gè)。

圖3 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)

2.5 構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)見圖4。基于藥物有效成分及靶點(diǎn)信息，使用Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中包含46 個(gè)節(jié)點(diǎn)、46 條邊，其中藍(lán)色菱形代表靶點(diǎn)，綠色圓形代表不同中藥，不同顏色正方形代表不同中藥的藥物有效成分。網(wǎng)絡(luò)顯示，甘草（GC）重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有4 種，分別為：槲皮素（MOL000098）、異鼠李素（MOL000354）、柚皮素（MOL004328）、山奈酚（MOL000422）。川芎（CX）重塑食管癌微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有1 種，為：楊梅酮（MOL002135）。熟地黃（SDH）重塑食管癌微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有1 種，為：豆甾醇（MOL000449）。當(dāng)歸（DG）重塑食管癌微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有2 種，為：豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）。人參（RS）重塑食管癌微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有4 種，為：豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）、人參皂苷Rh2（MOL005344）、山奈酚（MOL000422）。白芍（BS）重塑食管癌微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分有3 種，為β-谷甾醇（MOL000358）、山奈酚（MOL000422）、芍藥苷（MOL001924），其中茯苓（FL）、白術(shù)（BZ）無對(duì)應(yīng)有效成分。甘草（GC）為連線數(shù)量最多的節(jié)點(diǎn)，其主要有效成分如槲皮素、山奈酚可能是八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境并影響食管癌預(yù)后的潛在成分，其中山奈酚也是人參和白芍的有效成分之一。

圖4 中藥-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白獲取見圖5。將八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有29 個(gè)節(jié)點(diǎn)，112 條邊。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯贑ytoHubba 插件計(jì)算評(píng)分。得到八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)展示前5 個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。

圖5 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境核心靶點(diǎn)

2.7 GO 功能與KEGG 通路富集分析見圖6。為了揭示篩選出的八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因在食管癌進(jìn)展中的生物學(xué)意義，使用DAVID 網(wǎng)站對(duì)其31 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，F(xiàn)DR＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO 富集分析結(jié)果顯示八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因主要涉及以下幾方面。①M(fèi)F：相同蛋白質(zhì)結(jié)合、趨化因子活性、CXCR 趨化因子受體結(jié)合；②BP：炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖的調(diào)控、類固醇代謝過程、血管生成的正負(fù)調(diào)節(jié)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、血液循環(huán)等生物學(xué)過程；③CC：受體復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外空隙等細(xì)胞組分。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示共有靶點(diǎn)主要與趨化因子信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路相關(guān)。根據(jù)富集結(jié)果可以推測(cè)出八珍湯可能通過趨化因子信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等重塑食管癌腫瘤微環(huán)境從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥等。

圖6 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因的GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.8 分子對(duì)接見表1、圖7。為了更明確地探求八珍湯重塑食管癌腫瘤微環(huán)境的治療機(jī)制，將上述核心靶點(diǎn)ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1分別與各自對(duì)應(yīng)的有效成分山奈酚、槲皮素進(jìn)行分子對(duì)接。各有效成分與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合自由能均小于-1.2 kcal/mol，提示對(duì)接結(jié)果良好，提示八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵靶點(diǎn)有良好的結(jié)合作用。

表1 八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

圖7 八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)靶點(diǎn)分子對(duì)接構(gòu)象圖

3 討論

氣血雙補(bǔ)之劑八珍湯在臨床上使用廣泛，其由健脾益氣作用的四君子湯和養(yǎng)血活血的四物湯組成，由此方為底加減化裁，對(duì)于腫瘤患者氣血兩虛證有良好的功效。食管癌患者由于其腫瘤部位以及腫瘤形成原因特殊，患者常常表現(xiàn)出消瘦、氣血不足的表現(xiàn)，大量研究以及臨床經(jīng)驗(yàn)表明八珍湯對(duì)改善食管癌患者生活質(zhì)量具有重要作用[13-14]，但是其具體機(jī)制尚不清楚。隨著信息時(shí)代的發(fā)展，運(yùn)用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)能夠從大量數(shù)據(jù)中尋找藥物的有效成分和疾病作用靶點(diǎn)，從而探索藥物對(duì)疾病的藥理作用及其機(jī)制。分子對(duì)接技術(shù)已廣泛運(yùn)用于藥物有效成分的篩選、發(fā)現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)相互作用的機(jī)制。“種子與土壤”假說形象地揭示了癌癥的擴(kuò)散和生長(zhǎng)很依賴周圍的“微環(huán)境”。而中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)在于改善整個(gè)機(jī)體的微環(huán)境從而達(dá)到治療疾病的目的，不僅可以直接消滅致癌“種子”，還可以改善腫瘤生長(zhǎng)依賴的“土壤環(huán)境”[15]。由于八珍湯治療腫瘤旨在改善腫瘤患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)其生存期，尚無研究證實(shí)八珍湯能夠直接殺滅腫瘤，說明八珍湯治療食管癌的機(jī)制主要在于重塑腫瘤生長(zhǎng)的環(huán)境從而發(fā)揮治療作用，所以，本研究基于生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法旨在從腫瘤微環(huán)境層面探討八珍湯治療食管癌的作用機(jī)制，并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)科學(xué)實(shí)現(xiàn)藥物有效成分與靶點(diǎn)的有效銜接，進(jìn)一步探索八珍湯重塑食管癌更微觀的分子機(jī)制。

本研究首先基于TCGA 食管癌患者臨床信息和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析得到與食管癌患者預(yù)后密切相關(guān)的基因，并通過與八珍湯有效成分靶點(diǎn)取交集獲得八珍湯潛在的作用靶點(diǎn)，并對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結(jié)果顯示八珍湯調(diào)節(jié)食管癌腫瘤微環(huán)境的靶點(diǎn)主要富集于趨化因子活性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、類固醇代謝、血管生成、細(xì)胞黏附、血液循環(huán)等方面。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示八珍湯調(diào)節(jié)食管癌腫瘤微環(huán)境的靶點(diǎn)主要與趨化因子信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等密切相關(guān)。研究表明趨化因子[16]、炎癥反應(yīng)[17-18]、血管生成[19]、細(xì)胞黏附[20]等與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。眾多趨化因子被證明影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、化學(xué)耐藥等。如干細(xì)胞自分泌CXC 基序趨化因子配體12（CXCL12）/CXC 基序趨化因子受體4（CXCR4）刺激食管癌侵襲轉(zhuǎn)移[21]；癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的白細(xì)胞介素-6（IL-6）通過上調(diào)CXC基序趨化因子受體7（CXCR7）的表達(dá)，從而在化療耐藥中發(fā)揮最重要的作用[22]，CXC 基序趨化因子配體5（CXCL5）通過增強(qiáng)結(jié)直腸癌中AKT/NF-κB 通路介導(dǎo)的FOXD1 表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤血管生成[23]。腫瘤壞死因子（TNF）是一種主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生能直接殺傷腫瘤細(xì)胞且對(duì)正常細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的TNF 信號(hào)通路的激活可引發(fā)腫瘤細(xì)胞溶解或細(xì)胞死亡[24]。NF-κB 通路由經(jīng)典和非經(jīng)典通路組成。典型的NF-κB 調(diào)節(jié)各種促炎基因的表達(dá)，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。非經(jīng)典NF-κB 通路的激活通過少數(shù)TNF 受體超家族成員發(fā)生。失調(diào)的NF-κB活性會(huì)導(dǎo)致炎癥相關(guān)疾病和癌癥的發(fā)生[25]?？傊?，GO 和KEGG 富集分析的結(jié)果中相關(guān)通路和生物功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

同時(shí)，根據(jù)八珍湯重塑食管癌中的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系根據(jù)連接的度值排序篩選得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。這5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)揮相應(yīng)的功能。細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）編碼一種在內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的ICAM1 可以通過促進(jìn)腫瘤免疫細(xì)胞黏附相互作用或通過傳遞由外而內(nèi)的信號(hào)來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞功能而影響腫瘤的發(fā)展[26]。同時(shí)ICAM1 引起T 細(xì)胞募集會(huì)損害浸潤(rùn)性T 細(xì)胞的效應(yīng)功能，從而使腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫識(shí)別和殺傷[27]。血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM1）編碼一種由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面唾液酸糖蛋白。炎癥中由白細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面VCAM1 的表達(dá)，活化后的VCAM1 直接與白細(xì)胞上的α4β1 整合素相互作用反過來激活VCAM1 下游信號(hào)分子最終影響白細(xì)胞遷移。VCAM1 的表達(dá)影響白細(xì)胞的黏附功能進(jìn)一步影響腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[28]。研究表明，癌細(xì)胞上VCAM1 的表達(dá)影響微環(huán)境中播散性腫瘤細(xì)胞（DTC）和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用從而影響遠(yuǎn)端器官的腫瘤定植[29]。可見VCAM1 在通過影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的黏附功能進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。CC 基序趨化因子配體2（CCL2）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。CCL2 是一種有效的單核細(xì)胞吸引趨化因子，基質(zhì)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)（如IL-1、IL-6、TNF-α 或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β）可上調(diào)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2，從而刺激腫瘤細(xì)胞釋放促血管生成因子VEGF-A 而誘導(dǎo)腫瘤血管生成，同時(shí)由基質(zhì)細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2 能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞募集到乳腺癌組織中發(fā)揮抗腫瘤作用[30]。CCL2 可能具有促進(jìn)腫瘤、抑制腫瘤的活性，或兩者兼而有之[31]。其具體作用還要視具體情況而定，總體來說，CCL2 能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明CXCL10 有望成為治療自身免疫性疾病、癌癥等的有效靶點(diǎn)，成為關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)趨化因子[32]。趨化因子是一類具有誘導(dǎo)趨化性、促進(jìn)免疫細(xì)胞分化和引起組織外滲作用的蛋白質(zhì)。鑒于這些特性，它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中的作用非常重要。趨化因子CXCL9、CXCL10 以及CXCL11/CXCR3軸調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞遷移、分化和激活，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[32]。因此，趨化因子相關(guān)信號(hào)軸在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。STAT1 是干擾素（IFN）信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分，主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[33]，研究表明，STAT1 能夠增強(qiáng)頭頸部鱗癌腫瘤微環(huán)境中的T 細(xì)胞抗腫瘤免疫力[34]，故激活STAT1 在癌細(xì)胞中起到抑癌作用。然而，STAT1 在特定條件下也發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用[35]。研究表明，在人乳腺癌細(xì)胞中單獨(dú)抑制STAT1 和STAT3 激活能部分下調(diào)PD-L1，而聯(lián)合抑制則完全下調(diào)PD-L1 表達(dá)[36]。說明STAT1 可以通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上某些蛋白的表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)富集結(jié)果可以推測(cè)出八珍湯可能通過靶向ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1 激活趨化因子信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等重塑食管癌的腫瘤微環(huán)境，從而影響食管癌增殖、凋亡、遷移、血管生成。研究表明食管鱗狀細(xì)胞癌中的STAT1 信號(hào)下調(diào)了具有致癌潛力的NF-κB 和STAT3 的表達(dá)或活性[37]，同時(shí)STAT1 可以通過下調(diào)TNF-α 來阻斷NF-κB[37]。李閃閃等[38]通過查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，中藥可以通過調(diào)控PI3K/Akt、Wnt/βcatenin、MAPK、Notch、NF-κB、JAK2/STAT3 等多個(gè)信號(hào)通路治療食管癌。所以，富集分析的結(jié)果對(duì)于后續(xù)食管癌治療靶點(diǎn)和分子機(jī)制研究具有一定指導(dǎo)意義。Chen X M 等[39]的研究表明藏紅花的提取物羥基紅花黃色素A 可抑制ICAM1、MMP9、TNF-α和VCAM1 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路抑制食管癌細(xì)胞的惡性發(fā)展。說明基于中藥單個(gè)成分的分子機(jī)制研究有助于闡釋中藥的藥理作用機(jī)制。故本研究通過分子對(duì)接技術(shù)證實(shí)八珍湯部分有效成分確實(shí)能夠靶向食管癌腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)靶點(diǎn)。同時(shí)已有大量研究證實(shí)八珍湯的有效成分槲皮素[40-41]、山奈酚[42]能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成。故基于八珍湯有效成分和食管癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)之間相互作用的分子機(jī)制的探索，有助于闡釋八珍湯治療食管癌的腫瘤微環(huán)境相關(guān)分子機(jī)制。由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，且腫瘤微環(huán)境也是復(fù)雜多變的腫瘤生態(tài)環(huán)境，故探索中藥治療腫瘤的分子機(jī)制從腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行探索，更能從整體闡釋中藥抗腫瘤的作用機(jī)制，而不是局限于單純殺滅腫瘤。

綜上所述，本研究為探索八珍湯干預(yù)食管癌腫瘤微環(huán)境的靶點(diǎn)和機(jī)制，采用綜合生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接的方法進(jìn)行研究，不僅為臨床應(yīng)用八珍湯治療食管癌提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，還為進(jìn)一步深入機(jī)制研究提供參考。本研究篩選出5 個(gè)具有重要意義的靶基因作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的候選基因，即ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。同時(shí)通過大量參考文獻(xiàn)也證實(shí)這些基因在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面具有重要意義，所以有希望成為八珍湯調(diào)節(jié)食管癌腫瘤微環(huán)境的作用靶點(diǎn)。