韓慶亮，張慧，鄭慧軍

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

膠質(zhì)瘤是由大腦及脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所致的原發(fā)性腦腫瘤，是發(fā)病率較高的腫瘤之一。盡管行手術(shù)積極治療可顯著改善病情，但由于腫瘤易復(fù)發(fā)且化療和放療耐藥性高，患者預(yù)后較差。中醫(yī)藥在腫瘤治療中發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的作用，從天然產(chǎn)物中尋找新的高效低毒的抗膠質(zhì)瘤藥物成為研究熱點(diǎn)[1]。大黃酚是大黃中提取出的一種天然蒽醌類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理作用[2-4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大黃酚對(duì)直腸癌、宮頸癌、肺癌等腫瘤有著一定抑制作用[5-7]。然而，大黃酚在膠質(zhì)瘤中是否具有抗癌活性，以及所介導(dǎo)的腫瘤抑制功能涉及哪些分子機(jī)制尚不清楚。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成中起重要作用，Wnt/β-catenin 通路的異常表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性腫瘤密切相關(guān)[8]。因此，本研究主要從大黃酚對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)控作用來(lái)分析其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與藥物膠質(zhì)瘤U87MG 細(xì)胞株購(gòu)自上海賽百慷生物科技有限公司，大黃酚（分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，貨號(hào)：B20238-20mg）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號(hào)：11011-8611），二甲基亞砜（DMSO）（德國(guó)Sigma-Aldrich 公司，貨號(hào)：D2650），DMEM 培養(yǎng)基（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：iCell-0005），24 孔Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司，貨號(hào)：CLS3378），Matrigel 基質(zhì)膠（美國(guó)BD 公司，貨號(hào)：356234），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗混合液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：24800-50、T1350-100、P1400），AnnexinV-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：ECK-A211），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物科技公司，貨號(hào)：P0012），RIPA 細(xì)胞裂解液（美國(guó)GLPBIO 公司，貨號(hào)：GK10023），CCK-8 試劑盒、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP 標(biāo)記山羊抗兔、β-actin、GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司， 貨號(hào)： PF00004、 PK10002、SA00001- 2、81115-1-RR、10494-1-AP），兔抗人Bax、Bcl-2、β-catenin、E-cadherin、vimentin、MMP-9 單克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab32503、ab182858、ab305261、ab40772、ab92547、ab137867）。酶標(biāo)儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)：3120、FC型），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；蛋白凝膠、電泳成像系統(tǒng)（BIO RAD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 大黃酚預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)相關(guān)分析在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，以大黃酚（CAS 號(hào)481-74-3）為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，查找大黃酚的SDF 結(jié)構(gòu)，并下載保存。并利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)大黃酚的潛在作用靶點(diǎn)。將“glioma”作為關(guān)鍵詞在GeneCareds（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索出膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)。將大黃酚的潛在靶點(diǎn)和膠質(zhì)瘤的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取交集最終獲得“大黃酚-膠質(zhì)瘤”的交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），選擇物種為“Homosapiens”，最小相互作用分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.700，然后獲得蛋白互作關(guān)系并查看相關(guān)通路。

1.2.2 分組及細(xì)胞培養(yǎng)將U87 細(xì)胞分為4 組，分別為對(duì)照組（0 μmol/L），低、中、高劑量組（分別給予50、100、200 μmol/L 的大黃酚處理）。膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞用10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞接近80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞，將2×104/孔的U87 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組6 個(gè)復(fù)孔，鏡下觀察細(xì)胞完全貼壁后，加入大黃酚（50、100、200 μmol/L）分別處理24、48 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膠質(zhì)癌U87 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔接種2×105個(gè)，待細(xì)胞鋪滿后，用100 μL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，劃線完成后，用PBS 洗滌漂浮細(xì)胞，并拍照記錄劃痕位置，然后加入新鮮無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基和不同濃度的大黃酚（50、100、200 μmol/L）。在CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用不同濃度的大黃酚（50、100、200 μmol/L）處理U87 細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度后，在Transwell 小室上室加100 μL 細(xì)胞懸液，將下室內(nèi)加入DMEM 培養(yǎng)液500 μL，每組3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h。取出小室，PBS洗滌2 次，棉簽輕輕擦拭，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗滌并晾干，隨機(jī)選取3 個(gè)視野在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡按“1.2.2 項(xiàng)”方法處理U87 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后用2 mL EP 管收集細(xì)胞，低溫離心后PBS 洗滌2 次，按照Annexin VFITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書要求，在EP 管中加入500 μL 的Binding Buffer 重懸細(xì)胞，再各加入5 μL Annexin V-FITC 和PI 的染液，室溫避光孵育15 min 后，采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 以及Wnt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)按“1.2.2 項(xiàng)”方法處理U87 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液，冰浴1 h 后，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，行SDSPAGE 電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，奶粉稀釋一抗：兔抗人Bax（1∶1 000）和Bcl-2（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）與MMP-9 單克隆抗體（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）于4 ℃冰箱搖床過夜。二抗：HRP 標(biāo)記山羊抗兔（1∶5 000）室溫孵育1 h，上機(jī)觀察蛋白信號(hào)。采用image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析法（One-way ANOVA），所有統(tǒng)計(jì)分析均采用GraphPad Prism 軟件作圖。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)構(gòu)建與分析見圖1。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)大黃酚的結(jié)構(gòu)，通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)化合物預(yù)測(cè)產(chǎn)生的靶點(diǎn)進(jìn)行篩檢與檢查，剔除重復(fù)、非人源與不規(guī)范的靶點(diǎn)，最終得到100 個(gè)靶點(diǎn)。借助GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“glioma”為關(guān)鍵詞，共獲得惡性膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)10 231 個(gè)。從圖1 可見，對(duì)大黃酚預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)和膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)進(jìn)行交互處理，得到83 個(gè)共同靶點(diǎn)。利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，最終發(fā)現(xiàn)大黃酚與Wnt 信號(hào)通路下游相關(guān)蛋白GSK3-β、MMP 等較為密切，并選取Wnt/β-catenin 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)通路，驗(yàn)證大黃酚是否通過該通路來(lái)抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。

圖1 大黃酚預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)交互圖

2.2 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖的影響見圖2。與對(duì)照組比較，不同濃度的大黃酚在24、48 h 作用時(shí)間里對(duì)U87 細(xì)胞的增殖活性降低（P＜0.01），并具有時(shí)間和濃度依賴性。大黃酚作用24 h 后U87 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為118.1 μmol/L，因此選取24 h 為后續(xù)藥物作用時(shí)間。

圖2 大黃酚對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞遷移能力的影響見圖3。與對(duì)照組比較，不同濃度的大黃酚與U87 細(xì)胞作用24 h 后，U87 細(xì)胞遷移能力明顯減弱（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，抑制遷移能力增強(qiáng)。

圖3 大黃酚對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

2.4 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞侵襲能力的影響見圖4。與對(duì)照組比較，大黃酚低、中、高劑量組中侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），呈濃度依賴性。

圖4 大黃酚對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

2.5 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞凋亡的影響見圖5。與對(duì)照組比較，當(dāng)大黃酚濃度為50 μmol/L，不能促進(jìn)U87 細(xì)胞凋亡（P＞0.05）；大黃酚濃度為100、200 μmol/L，能促進(jìn)U87 細(xì)胞凋亡（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

圖5 大黃酚對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞凋亡的影響

2.6 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 的影響見圖6。與對(duì)照組比較，在大黃酚低劑量組中，Bax 和Bcl-2 的蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05）；在大黃酚中、高劑量組中，Bax 的蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），Bcl-2 的蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

圖6 大黃酚對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞凋亡蛋白Bax 和Bcl-2 的影響

2.7 大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞Wnt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖7。與對(duì)照組比較，不同濃度大黃酚作用U87 細(xì)胞24 h 后，其所表達(dá)的β-catenin、vimentin 與MMP-9 的蛋白水平明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 的蛋白水平明顯增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

圖7 大黃酚對(duì)Wnt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膠質(zhì)瘤病位雖然在腦，但與肝、脾、腎等腑臟有關(guān)，痰、瘀、毒、虛為其主要致病因素。感受邪毒、飲食偏嗜是外在病因；精神情志失調(diào)、先天不足，或后天失養(yǎng)，或久病耗傷、正氣虛弱是膠質(zhì)瘤發(fā)病的內(nèi)在病因[10-11]。

大黃是多年生草本植物，藥用部位主要是根及根莖，具有攻積滯、清濕熱、瀉火、凉血、祛瘀、解毒等功效[12]。目前，大黃中的蒽醌類成分大黃酚已被證實(shí)對(duì)腫瘤發(fā)展有著很好的抑制作用[13]。代繼源等[14]發(fā)現(xiàn)，大黃酚可通過影響AMPK 信號(hào)通路因子能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲。Trybus W 等[6]發(fā)現(xiàn)，大黃酚可以通過影響線粒體途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。Zhang J 等[7]發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中大黃酚通過調(diào)節(jié)ROS/HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路來(lái)表現(xiàn)出抗癌活性。Park D 等[15]發(fā)現(xiàn)，大黃酚可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡，其主要機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，大黃酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，特別是對(duì)U87 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，大黃酚呈濃度依賴性，抑制膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡；大黃酚能使Bax 的表達(dá)量升高、Bcl-2 的表達(dá)量降低，并且能明顯減弱U87 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Wnt 信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、正常干細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用[8]。其下游關(guān)鍵因子β-catenin 的激活會(huì)引起上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其作用與各種癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移直接相關(guān)[16]。EMT 是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和黏附性從而轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的重要過程，間充質(zhì)細(xì)胞具有增加的侵襲性或轉(zhuǎn)移性表型[17]。EMT 引起的高侵襲和遷移能力可使手術(shù)難以完全切除腫瘤，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[18]。E-cadherin 表達(dá)降低能促進(jìn)EMT 和癌癥轉(zhuǎn)移[19]，vimentin 的過度表達(dá)與多種癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移增加有關(guān)[20-21]。MMP-9 已被發(fā)現(xiàn)與癌癥的病理學(xué)有關(guān)，與侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)[22]。MMP-9 在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可增加vimentin 的表達(dá)和降低E-cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)EMT 的發(fā)生。因此，抑制EMT 相關(guān)通路是抗腫瘤藥物的重要作用機(jī)制[23-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃酚能顯著抑制U87 細(xì)胞的β-catenin、MMP-9、vimentin 表達(dá)，促進(jìn)Ecadherin 表達(dá)，提示大黃酚能夠阻斷U87 細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而降低膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，通過預(yù)測(cè)大黃酚靶點(diǎn)與膠質(zhì)瘤的相互作用，并驗(yàn)證了大黃酚能夠抑制U87 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。