馮時(shí)茵，曲新艷，饒秋紅，戚揚(yáng)，廖小紅，丘振文，陳斌

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是常見消化系統(tǒng)疑難病，病理變化呈慢性炎癥反應(yīng)，可累及直腸、結(jié)腸，具體病因尚未明確，一般認(rèn)為與多種遺傳及環(huán)境因素關(guān)系密切，臨床以反復(fù)發(fā)作、病情遷延為特點(diǎn)[1]。西醫(yī)針對(duì)UC 主要以藥物治療為主，一線藥物主要包括氨基水楊酸類、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等。其中氨基水楊酸類藥物的緩解率約為50%，可緩解輕、中度活動(dòng)期UC 患者癥狀；而皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑治療存在服藥周期長(zhǎng)、毒副作用大、病情易復(fù)發(fā)、診療費(fèi)用高等諸多不足，使臨床治療受到極大限制[2-3]。因此，尋找安全有效、副作用小的UC 治療方案迫在眉睫。近年來有研究表明，中醫(yī)藥治療UC 療效明確，能有效預(yù)防復(fù)發(fā)，且副作用少[4-7]。臨床上以四神丸加減方治療脾腎陽虛型UC 療效顯著，但具體治療機(jī)制尚不明確。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）構(gòu)建小鼠UC 模型，探討四神丸加減方治療UC 的療效機(jī)制。結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性C57BL/6 小鼠，SPF 級(jí)，7～8 周，共30 只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。

1.2 主要試劑及儀器DSS 購自MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪腸溶片（Losan Pharma GmbH 公司，國藥準(zhǔn)字號(hào)H20171358，規(guī)格：500 mg/粒）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；Toll 樣受體4（TLR4）、p65 分子量、磷酸化P65（pp65）和β-actin 抗體購于Cell Signaling Technology公司。

2 研究方法

2.1 造模方法以7～8 周齡雌性C57BL/6 小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，小鼠自由飲用無菌水配置的2.5% DSS 溶液，連續(xù)7 d（每3 d 更換DSS 溶液1 次）[8]。

2.2 藥液制備四神丸加減處方：黃芪、白術(shù)各20 g，補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、土茯苓各15 g，五味子、烏梅、淡附子、川芎、當(dāng)歸、麩炒枳殼各10 g，黃連6 g，吳茱萸5 g。取中藥飲片總質(zhì)量的10 倍水浸泡藥材60 min，大火煮沸后改為文火保持沸騰狀態(tài)煮50 min，濾取煎液，然后再加中藥飲片總量的8 倍量水，大火煮沸后改為文火保持沸騰狀態(tài)煮30 min，濾取煎液，合并2 次煎液，并將其加熱濃縮至含生藥2 g/mL的藥液，冷卻后于4 ℃儲(chǔ)存，使用時(shí)按照各組給藥劑量進(jìn)行稀釋。

2.3 給藥方法將30 只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、四神丸加減方高劑量組（簡(jiǎn)稱高劑量組）和四神丸加減方低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組）各6 只，陽性對(duì)照組以美沙拉嗪腸溶片按照400 mg/kg劑量灌胃，四神丸加減方2 個(gè)劑量組分別按照400、200 mg/kg 劑量灌胃，正常組和模型組予等體積無菌水灌胃，均給藥7 d。其中，模型組、陽性對(duì)照組、高劑量組和低劑量組都給予2.5%的DSS 進(jìn)行造模，正常組小鼠飲用常規(guī)飲用水。

3 觀察指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.1 觀察指標(biāo)①小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。自造模第1 天起，每天觀察小鼠精神狀態(tài)并稱重；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后根據(jù)體質(zhì)量、大便性狀、大便隱血/肉眼血便的評(píng)分（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1）計(jì)算DAI，DAI=體質(zhì)量下降評(píng)分+糞便黏稠度評(píng)分+便血評(píng)分。②小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組小鼠結(jié)腸組織并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量記錄。③結(jié)腸組織病理學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，截取小鼠近端結(jié)腸，于4%中性甲醛溶液中固定24 h 以上，用石蠟包埋，切成5 μm 的連續(xù)切片，然后進(jìn)行脫蠟處理，再進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化情況。④結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)。收集各組小鼠結(jié)腸組織，并將結(jié)腸組織和磷酸鹽緩沖液按照1∶20 的比例進(jìn)行研磨、離心，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)結(jié)腸組織研磨液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)水平。⑤結(jié)腸組織中TLR4、p65 和p-p65、β-actin 蛋白表達(dá)。提取各組小鼠結(jié)腸總蛋白，進(jìn)行蛋白定量和變性后，按照每孔30 μg 的標(biāo)準(zhǔn)上樣，之后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，分別孵育一抗和二抗，顯色后將載有目的蛋白的聚偏二氟乙烯膜置于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中，檢測(cè)TLR4、p65 和p-p65 等蛋白表達(dá)水平，以β-actin 作為內(nèi)參蛋白。

表1 小鼠體質(zhì)量下降、大便性狀和便血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 研究結(jié)果

4.1 5 組小鼠DAI 評(píng)分比較見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組小鼠DAI 評(píng)分較正常組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組和高劑量組小鼠DAI 評(píng)分結(jié)果均顯著下降（P＜0.05），而低劑量組小鼠DAI 評(píng)分無明顯變化（P＞0.05）。

表2 5 組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s）分

表2 5 組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s）分

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

DAI 0.0±0.0 9.9±0.7①7.1±0.9②6.7±2.1②9.4±1.9組 別正常組模型組陽性對(duì)照組高劑量組低劑量組鼠數(shù)66666

4.2 5 組小鼠UC 嚴(yán)重程度比較見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較正常組縮短（P＜0.05）、糞便黏稠度及便血評(píng)分升高（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加（P＜0.05），而陽性對(duì)照組、低劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性對(duì)照組及高、低劑量組小鼠糞便黏稠度評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；陽性對(duì)照組及高、低劑量組小鼠便血評(píng)分無明顯變化（P＞0.05）。

表3 5 組小鼠UC 嚴(yán)重程度比較（±s）

表3 5 組小鼠UC 嚴(yán)重程度比較（±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

便血評(píng)分（分）0.0±0.0 2.1±0.4①1.9±0.7 2.0±0.6 2.9±0.4組 別正常組模型組陽性對(duì)照組高劑量組低劑量組鼠數(shù)66666結(jié)腸長(zhǎng)度（cm）7.0±0.5 5.1±0.5①5.4±0.4 6.0±0.8②5.2±0.7糞便黏稠度評(píng)分（分）0.0±0.0 4.0±0.0①2.0±0.0②2.4±0.5②3.0±1.0②

4.3 5 組小鼠結(jié)腸組織病理結(jié)果比較見圖1。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞明顯減少，隱窩結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)。與模型組比較，陽性對(duì)照組、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞增多，隱窩結(jié)構(gòu)損傷減少，炎癥浸潤(rùn)程度明顯改善；而低劑量組上述病理變化略有改善。

4.4 5 組結(jié)腸組織中IL-6、IL-10 表達(dá)水平比較見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-6水平較正常組顯著升高（P＜0.05），IL-10 水平較正常組顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），陽性對(duì)照組及低劑量組IL-6 水平下降不明顯（P＞0.05）；高、低劑量組IL-10 水平顯著升高（P＜0.05），陽性對(duì)照組IL-10水平升高不明顯（P＞0.05）。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-10 水平比較（±s） pg/mL

表4 各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-10 水平比較（±s） pg/mL

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

IL-10 50 242.0±7 227.0 5 645.0±1 583.0①8 078.0±1 774.0 22 267.0±6 792.0②14 275.0±2 731.0②組 別正常組模型組陽性對(duì)照組高劑量組低劑量組鼠數(shù)66666 IL-6 2 227.0±587.7 10 439.0±2 817.0①7 215.0±2 261.0 3 120.0±879.6②9 791.0±3 295.0

4.5 5 組結(jié)腸組織TLR4、p65 和p-p65 蛋白表達(dá)水平比較見圖2、表5。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p65 和p-p65 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組及高、低劑量組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p65 和p-p65 的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖2 5 組結(jié)腸組織TLR4、p65、p-p65、β-actin 蛋白表達(dá)

表5 5 組小鼠結(jié)腸組織TLR4、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表5 5 組小鼠結(jié)腸組織TLR4、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

p-p65 0.3±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.9±0.0②0.9±0.0②組 別正常組模型組陽性對(duì)照組高劑量組低劑量組鼠數(shù)66666 TLR4 0.4±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.8±0.0②0.7±0.0②p65 0.6±0.0 1.4±0.0①1.1±0.0②0.9±0.0②1.0±0.4②

5 討論

UC 是一種原因尚不完全明確的慢性非特異性大腸炎癥性疾病，病變主要限于直腸和結(jié)腸的黏膜層及黏膜下層，通常以腹痛腹瀉、膿血便、里急后重為主要臨床癥狀，該病病程綿延難愈，易反復(fù)發(fā)作，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。近年來，我國UC 發(fā)病率明顯增高，其中北方地區(qū)發(fā)病率為1.64/10 萬，南方地區(qū)發(fā)病率為2.05/10 萬[9-10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般采用口服氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療UC，如病灶在結(jié)腸遠(yuǎn)端可給予保留灌腸或者肛門給藥的方式，使藥物在腸道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間緩慢吸收。在藥物治療效果不佳且出現(xiàn)腸道穿孔、出血、惡變等情況下可以考慮外科治療，但也無法完全控制病情發(fā)展，故UC 已被世界衛(wèi)生組織列為當(dāng)代難治性疾病之一。

中醫(yī)學(xué)古籍中并無UC 對(duì)應(yīng)的病名，按其癥狀表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué)腸澼、便血、腸風(fēng)下血、痢疾、泄瀉、滯下、腹痛、臟毒、久痢等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，此病與勞逸不當(dāng)、外感時(shí)邪、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、七情內(nèi)傷、飲食不節(jié)等多種因素有關(guān)，多由于飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷、勞倦過度、脾腎陽虛、感受濕邪等所致[11]。而脾腎陽虛是UC 常見證型之一，主要是因?yàn)椴〕搪L(zhǎng)、反復(fù)難愈，脾氣不升、中氣下陷，損傷脾陽，累及腎陽，最終導(dǎo)致脾腎陽虛。UC 為本虛標(biāo)實(shí)之證，其中活動(dòng)期以標(biāo)實(shí)為主，多為濕熱血瘀；緩解期以本虛為主，多表現(xiàn)為脾陽虛，也有兼腎陽不足的情況。筆者通過對(duì)相關(guān)的文獻(xiàn)梳理與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，分析古今醫(yī)家對(duì)UC 病因病機(jī)的理論認(rèn)識(shí)，結(jié)合廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病名家經(jīng)驗(yàn)[12-13]，同時(shí)通過綜合專家經(jīng)驗(yàn)辨證，提取證候要素，總結(jié)該病常見證候及證候要素分布的特點(diǎn)[14-15]，皆發(fā)現(xiàn)脾腎陽虛證為慢性UC 的重要證型。四神丸是中醫(yī)治療脾腎陽虛型泄瀉的代表方劑，故本研究選用四神丸加減方作為觀察方劑進(jìn)行研究。

四神丸加減方方中補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽，溫脾止瀉；肉豆蔻溫中澀腸，主虛瀉冷??；吳茱萸溫中助陽，專治臟寒泄瀉。三者為君藥，共奏溫脾腎陽、澀腸止瀉之功。五味子、烏梅皆性酸，五味子收斂固澀，烏梅收澀止??；附子振奮腎陽，溫暖脾土；三者共為臣藥，以助君藥溫陽收澀。黃芪、白術(shù)益氣扶正，利水除濕；川芎、當(dāng)歸行氣活血；土茯苓解毒祛濕，黃連解毒清熱，六者佐治兼證，有益氣活血、解毒清熱、除濕止瀉之功。炒枳殼行氣導(dǎo)滯，調(diào)和諸藥，為使藥。本研究所用加減方在四神丸溫腎散寒的基礎(chǔ)上加入澀腸止瀉、益氣活血、清熱利濕解毒之品組成，寒溫并用，共奏祛邪扶正、氣血雙調(diào)、澀腸止痢之功。

本研究采用DSS 構(gòu)建小鼠UC 模型，評(píng)估四神丸加減方緩解UC 的效果及其機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組小鼠DAI 均顯著下降；高劑量組能顯著減輕小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短及腹瀉情況，低劑量組也可改善小鼠腹瀉情況。杯狀細(xì)胞減少、隱窩結(jié)構(gòu)喪失和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加是DSS 引起的結(jié)腸損傷結(jié)果[16]，本研究結(jié)果顯示，高劑量組可明顯改善小鼠結(jié)腸組織的杯狀細(xì)胞減少、隱窩結(jié)構(gòu)損傷及炎癥浸潤(rùn)情況；低劑量組對(duì)小鼠結(jié)腸組織的腺體損傷的炎癥浸潤(rùn)情況稍有改善。作為腸道炎癥的重要指標(biāo)，促炎細(xì)胞因子IL-6 在UC 誘導(dǎo)后顯著增加，而IL-10 在抑制腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，高劑量組小鼠結(jié)腸組織中IL-6 表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降，而高、低劑量組均可明顯提高小鼠結(jié)腸組織中的IL-10的表達(dá)水平。

TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活可增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)過程中具有重要作用。作為TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的效應(yīng)蛋白，正常情況下p65和p52 蛋白、IκB 在胞質(zhì)中形成穩(wěn)定的復(fù)合體，TLR4 被配體激活后，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域招募MyD88，磷酸化IκB 激酶（IKK），磷酸化的IKK 進(jìn)一步激活I(lǐng)κB，激活后的IκB 會(huì)釋放復(fù)合體中的p65 并將其磷酸化，磷酸化后p65 進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。同時(shí)，IκB 也可以進(jìn)入細(xì)胞核，競(jìng)爭(zhēng)性抑制p-p65 的轉(zhuǎn)錄活性，所以細(xì)胞中p65 的增多可以在胞質(zhì)中與IκB結(jié)合，減少IκB 的入核，同時(shí)可以生成更多的p-p65進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，加劇炎癥反應(yīng)[19]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量組小鼠結(jié)腸組織中TLR4、p65 和p-p65 表達(dá)水平均降低，從而減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。以上研究不僅揭示了四神丸加減方的療效及其作用機(jī)制，也為闡釋中醫(yī)藥療效內(nèi)涵提供有益借鑒。