楊加珍，徐鶴萌，陳 佳，何 偉，曾亞文

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，昆明 650205；2.普洱學(xué)院，云南 普洱 665000；3.紅河麟源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，云南 河口 661300）

陽春砂（Amomum villosumLour.）與草果（Amomum tsaokoCrevost et Lemaire）均為豆蔻屬多年生草本植物。陽春砂屬亞熱帶半陰性植物，喜高溫、高濕，適合生長在600～800 m 低海拔的熱帶、南亞熱帶溫暖濕潤適當(dāng)陰蔽的闊葉常綠林地，大多栽培或野生于山地陰濕之處。陽春砂分布于云南、福建、廣東、廣西等省，云南省是陽春砂仁的主產(chǎn)區(qū)，其藥材產(chǎn)量占全國的70%以上。草果適宜生長在熱帶、亞熱帶濕熱陰蔽的闊葉林中和1 300～1 800 m 高海拔的林下陰濕處［1］，主要分布在中國云南、廣西和貴州三省的局部地區(qū)，在云南省主產(chǎn)于南部、東南部和西南部。葉是植物進(jìn)行呼吸、光合、蒸騰作用的重要器官，是植物應(yīng)對逆境脅迫最敏感的部位。生長在不同生態(tài)環(huán)境中的植物，表現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，是植物對特定生境的演化適應(yīng)［2］。葉片解剖結(jié)構(gòu)能夠反映植物對環(huán)境變化的響應(yīng)和適應(yīng)［3］，葉片的表皮結(jié)構(gòu)特征具有一定的遺傳穩(wěn)定性，在一定程度上葉片的表皮微形態(tài)特征可以反映植物類群間的親緣關(guān)系，在植物的種間、種內(nèi)分類上具有重要的研究意義［4，5］。氣孔是植物進(jìn)行蒸騰作用、光合作用和氣體交換的重要通道，是研究植物間親緣關(guān)系的重要器官［6，7］，氣孔研究已在許多植物中有報道。何荊洲等［8］揭示了25 個蝴蝶蘭品種葉片的氣孔特征指標(biāo)作為形態(tài)指標(biāo)和評價的重要依據(jù)。徐梅等［9］研究得出薯蕷屬（DioscoreaL.）植物葉表皮微形態(tài)存在差異，可作為種間分類的依據(jù)。陳方永等［10］用楊梅葉片氣孔的相似度作為區(qū)別楊梅品種的重要依據(jù)。王連珍等［11］揭示櫟屬（QuercusL.）植物葉片氣孔的穩(wěn)定性特征，可作為該屬植物親緣關(guān)系分析和分類的重要依據(jù)。近年來在草果與陽春砂在產(chǎn)業(yè)發(fā)展［12，13］、揮發(fā)油的提?。?4］、化學(xué)成分的鑒定［15］、藥理作用［16］、真假砂仁辨別［17］等研究方面取得了一定的進(jìn)展，但對其解剖學(xué)方面的研究較為鮮見。黃桂玲［18］揭示了砂仁的葉片為背腹型葉，氣孔常分布于下表皮，下表皮還含有油細(xì)胞，有一層?xùn)艡诮M織，海綿組織較疏松，含有草酸鈣結(jié)晶，葉脈表面的表皮中含有單個的圓球形的硅質(zhì)體。唐源江等［19］研究豆蔻屬（AmomumL.）的12 種植物葉片得出砂仁的遠(yuǎn)軸面和近軸面均有一層不連續(xù)的下皮層，且遠(yuǎn)軸面下皮層細(xì)胞體積小，近軸面下皮層細(xì)胞體積大；草果沒有下皮層細(xì)胞，砂仁與草果的葉肉均有1 層?xùn)艡诮M織，且砂仁葉肉組織含有少量方晶。唐源江等［20］對28 種姜科（Zingiberaceae）植物進(jìn)行了研究，表明3 種豆蔻屬（AmomumL.）植物的根表皮均由1 層表皮細(xì)胞組成，其中砂仁與草果的根含有表皮毛；皮層都由薄壁細(xì)胞組成，其中內(nèi)皮層細(xì)胞壁均呈U 形增厚，野草果較明顯，砂仁和草果則不明顯。為了解豆蔻屬2 種植物陽春砂與草果的形態(tài)特征及葉解剖結(jié)構(gòu)，本研究采用指甲油印痕法和超薄切片法制片，對2 種植物葉片的上、下表皮氣孔情況、葉片的橫切面以及葉片超微觀結(jié)構(gòu)比較分析。探討二者結(jié)構(gòu)是否存在差異性及葉片形態(tài)特征的種間差異，揭示其葉片形態(tài)差異的多樣性，以期為豆蔻屬植物的分類和親緣關(guān)系研究提供依據(jù)，也可以為適應(yīng)溫暖濕潤及其陰蔽的林下山區(qū)溝谷林栽培提供解剖結(jié)構(gòu)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 陽春砂植株，采自云南省紅河州河口縣老放寨鄉(xiāng)沙仁基地（海拔約700 m），屬于紅河麟源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；草果植株，采自云南省文山州馬關(guān)縣。

1.1.2 試驗設(shè)備 超薄切片機(jī)（EM UC7 型）、倒置熒光顯微鏡（DMI 4000B 型）、玻璃制刀機(jī)（EM KMR3 型）、修塊機(jī)（EM TRIM2 型）、組織處理機(jī)（EM TP 型），德國Lecia 公司；透射電子顯微鏡（TECNAI SPIRIT G2 型），美國FEI公司。

1.1.3 試驗試劑 2.5%戊二醛固定液、0.1 mol/L PBS 緩沖液、1.0%鋨酸、去離子水、無色指甲油、包埋劑、乙醇溶液（30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、95.0%、100.0%）、丙酮、甲苯胺藍(lán)染液、醋酸雙氧鈾染液、檸檬酸鉛染液。

1.1.4 試驗耗材 玻璃刀、濾紙、雙面刀片、鑷子、牙簽、載玻片、2 mL 離心管、0.5 mL 離心管、蓋玻片、膠頭滴管、酒精燈、透明膠帶。

1.2 方法

1.2.1 植物葉片上、下表皮氣孔觀察 采用指甲油印痕法［21］制片，取植物葉片中部葉脈兩側(cè)部分，切成1 cm×2 cm 的小塊，在葉片上、下表皮分別涂一層無色指甲油，待風(fēng)干后小心用透明膠帶將葉片上、下表皮指甲油輕輕撕下，置于載玻片上制片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，標(biāo)記氣孔數(shù)量、計數(shù)，測量氣孔大小及氣孔開度。每片葉片制作3 張切片，每張切片選取10 個清晰視野，分別測量相關(guān)指標(biāo)，取平均值作為該葉片的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.2.2 植物葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)觀察 參考鄧立紅［22］的超薄切片技術(shù)制片，并加以改進(jìn)，具體步驟如下：①取樣，采集無病植物葉片，沿著葉脈紋理用雙面刀片切成長條，于載玻片上再分段切成1 mm×2 mm 的小長條，切好后迅速用牙簽挑取放入有2.5%的戊二醛溶液的2 mL 離心管中；②抽真空，放入真空儀中抽真空5 min，抽去氣泡（空氣），使樣品完全浸沒于2.5%戊二醛溶液中；③前固定，2.5%戊二醛溶液固定72 h；④漂洗，用0.1 mol/L 的PBS 緩沖液（磷酸鹽緩沖劑和鹽水組成）漂洗3 次，15 min/次；⑤后固定，1.0% 鋨酸固定1.5 h；⑥再漂洗，用0.1 mol/L 的PBS 漂洗3 次，15 min/次；⑦梯度脫水，30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、90.0%、95.0%、100.0%乙醇溶液各級脫水15 min；⑧脫水，100.0%乙醇溶液二次脫水20 min 后，丙酮脫水20 min；⑨包埋，包埋劑+丙酮（1∶1）室溫1 h，包埋劑+丙酮（3∶1）室溫3 h；⑩純包埋過夜，用牙簽輕輕地從2 mL 離心管中取出樣品放在濾紙上，吸干液體（包埋劑+丙酮），選取2 個切樣好的樣品用牙簽挑起，裝入0.5 mL 離心管中（垂直背靠埋在純包埋劑底部），重復(fù)3 次；○1聚合，放入聚合箱中，60 ℃聚合24 h，聚合2 次；○12樹脂修塊，聚合成型后，取出樹脂包埋塊，切片機(jī)上修去多余樹脂，修成梯形，便于進(jìn)行半薄定位；○13半薄定位，把多余的樹脂修掉，露出組織塊，便于進(jìn)行超薄切片，同時，制成半薄切片，用甲苯胺藍(lán)染色后再用倒置熒光顯微鏡觀察葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)并拍照；○14超薄切片，將修好的生物樣品切片，厚度50～70 nm，用醋酸雙氧鈾染液和檸檬酸鉛染液染色；在透射電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽春砂與草果葉片表皮氣孔特征比較

如圖1 所示，在觀察的陽春砂和草果葉片材料中，上、下表皮均有氣孔分布，下表皮氣孔分布較多（圖1A、圖1B），下表皮氣孔分布不規(guī)則；上表皮氣孔分布較少，且上表皮氣孔大多分布在葉脈附近（圖1C、圖1D）。2 種植物的氣孔器均由2 個保衛(wèi)細(xì)胞和2 個副衛(wèi)細(xì)胞組成，保衛(wèi)細(xì)胞為腎形保衛(wèi)細(xì)胞，副衛(wèi)細(xì)胞近半圓形（圖1E、圖1F、圖1G、圖1H），氣孔器微向外凸。

圖1 陽春砂與草果葉片上、下表皮氣孔分布情況

如表1 所示，陽春砂和草果葉片的氣孔存在一定差異，其中陽春砂葉片的上、下表皮氣孔數(shù)目分別比草果葉片的上、下表皮氣孔數(shù)目多；草果的上、下表皮氣孔長度比陽春砂的上、下表皮氣孔長度長；草果的上、下表皮氣孔寬度分別比陽春砂的上、下表皮氣孔寬度略寬；草果的上表皮氣孔開度比陽春砂的上表皮氣孔開度略大，草果的下表皮氣孔開度較陽春砂的下表皮氣孔開度小。

表1 陽春砂與草果葉片的上、下表皮氣孔比較

陽春砂的上、下表皮氣孔也存在差異，下表皮氣孔數(shù)目比上表皮氣孔數(shù)目多13.7 倍，下表皮氣孔寬度比上表皮氣孔寬度寬17.4%，下表皮氣孔開度比上表皮氣孔開度大89.5%，下表皮氣孔長度比上表皮氣孔長度短10.6%。

草果的上、下表皮氣孔也存在差異，草果的下表皮氣孔數(shù)目比上表皮氣孔數(shù)目多12.5 倍，下表皮氣孔長度比上表皮氣孔長度長12.1%，下表皮氣孔寬度比上表皮氣孔寬度寬15.6%，下表皮氣孔開度比上表皮氣孔開度小42.3%。

2.2 陽春砂與草果葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)特征差異比較

如圖2A、圖2B 所示，從橫切面來看，2 種植物均為異面葉，陽春砂與草果的葉片均由表皮、葉肉和葉脈3 個部分組成。表皮分為上表皮和下表皮，表皮由單層表皮細(xì)胞組成，分別稱為上表皮細(xì)胞和下表皮細(xì)胞。表皮細(xì)胞近方形或不規(guī)則形，排列緊密，上表皮細(xì)胞較大，下表皮細(xì)胞較小。下表皮可觀察到氣孔器，對應(yīng)氣孔器的位置內(nèi)側(cè)處有孔下室。葉肉均包括柵欄組織和海綿組織，二者均有一層?xùn)艡诮M織，海綿組織不規(guī)則分布，有2～6 層細(xì)胞不等。草果葉片的柵欄組織和海綿組織的分化較明顯（圖2B），陽春砂葉片的柵欄組織和海綿組織的分化則不太明顯，且草果的柵欄組織排列更加整齊、規(guī)則。草果的上、下表皮細(xì)胞比陽春砂的上、下表皮細(xì)胞大。葉脈均由維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部組成。

2.3 陽春砂與草果葉片電鏡超微觀結(jié)構(gòu)特征比較

陽春砂與草果的葉片超微觀結(jié)構(gòu)如圖3A、圖3B 所示，其葉肉細(xì)胞共有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，原生質(zhì)體有葉綠體、線粒體。不同的是陽春砂葉片葉肉細(xì)胞的葉綠體中含有白色結(jié)晶狀的淀粉粒、黑色圓點狀的嗜鋨顆粒，細(xì)胞質(zhì)中含有黑灰色圓點狀的內(nèi)生菌（圖3A），而草果葉片葉肉細(xì)胞的葉綠體中含有灰色圓點狀的脂滴，細(xì)胞質(zhì)中不含內(nèi)生菌（圖3B）。陽春砂與草果葉片下表皮超微結(jié)構(gòu)的氣孔由2 個保衛(wèi)細(xì)胞圍合而成（圖3C、圖3D），陽春砂的保衛(wèi)細(xì)胞中含有葉綠體，葉綠體中含有淀粉粒（圖3C）；草果的保衛(wèi)細(xì)胞中也有葉綠體，但不含淀粉粒（圖3D）。

圖3 陽春砂與草果葉片橫切面超微觀結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 陽春砂和草果葉片氣孔特征

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，2 種植物的氣孔器均由2 個保衛(wèi)細(xì)胞和2 個副衛(wèi)細(xì)胞組成，保衛(wèi)細(xì)胞均為腎形保衛(wèi)細(xì)胞，副衛(wèi)細(xì)胞近半圓形。邱東萍等［23］、林植芳等［24］研究表明，陽生植物的氣孔都分布在下表皮，而陰生植物的上、下表皮都有氣孔分布，只是上表皮氣孔分布較少，下表皮氣孔分布較多。陽春砂和草果2 種植物葉片的氣孔上、下表皮均有分布，但大多分布于下表皮，這與黃桂玲［18］對砂仁的研究結(jié)果相吻合，與唐源江等［19］對豆蔻屬12 個種的葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致。陽春砂與草果葉片氣孔的分布特點說明二者具備半陰生植物的結(jié)構(gòu)特征。

3.2 陽春砂和草果葉片橫切面超微結(jié)構(gòu)特征

近年來，對豆蔻屬植物的研究主要集中在葉片表皮表觀特征方面［18，19］，對葉片橫切面結(jié)構(gòu)的研究較為鮮見，本研究主要采用超薄切片法對陽春砂和草果葉片切片后，再用透射電子顯微鏡對其葉片橫切面的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析。吳濤等［25］研究表明發(fā)達(dá)的海綿組織是葉片對水分充足、弱光環(huán)境的一種適應(yīng)特性，草果和陽春砂柵欄組織不發(fā)達(dá)，海綿組織較發(fā)達(dá)可能是對濕熱陰蔽的闊葉林下、林邊陰濕處條件適應(yīng)的結(jié)果。柵欄細(xì)胞是葉片進(jìn)行光合作用、制造有機(jī)物的主要場所，其發(fā)達(dá)程度與光合強(qiáng)度直接相關(guān)，反映植物光合組織的生境適應(yīng)能力，其厚度影響光合作用中對水分和光能的利用效率［26］。草果的柵欄組織排列整齊，且柵欄組織和海綿組織的分化較明顯，而陽春砂的這2 種組織分化不太明顯，表明草果的光合作用可能更強(qiáng)一些。

本研究發(fā)現(xiàn)，陽春砂與草果葉片下表皮超微結(jié)構(gòu)的氣孔由2 個保衛(wèi)細(xì)胞圍合而成，氣孔器的保衛(wèi)細(xì)胞中有葉綠體，蔣雅婷等［27］也觀察到了這一特征。陽春砂和草果的葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目都比較多，但陽春砂的葉綠體內(nèi)淀粉粒比較大、比較多，這與朱巧玲等［28］觀察的半陰生植物石斛的超微結(jié)構(gòu)相似，這可能是陽春砂和草果長期生長于林下陰蔽環(huán)境的結(jié)果。嗜鋨小滴的主要成分是葉綠體內(nèi)的親脂性脂類物質(zhì)，其生理功能可能是提供脂類倉庫的作用。姜建福等［29］對葡萄屬植物葉片的顯微和超微結(jié)構(gòu)研究表明有些葡萄葉綠體中含有較多的嗜鋨顆粒，預(yù)示著含有較強(qiáng)的抗性。范燕萍等［30］對花葉線藝蘭葉片的超微結(jié)構(gòu)研究時在基粒中觀察到有較多較大的淀粉粒，在基質(zhì)中存在較多嗜鋨滴。陽春砂葉片葉綠體中有較分散且數(shù)量少的嗜鋨顆粒，草果中并未發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒，卻積累了較多的脂滴，表明陽春砂對環(huán)境的適應(yīng)性可能會更強(qiáng)一些，還有待進(jìn)一步的研究。

觀測植物葉片的方法有很多，如印痕法、刮去葉肉法、明膠印跡法、超薄切片法、石蠟切片法等。石蠟切片法和超薄切片法一般適用觀察植物組織的橫切面，本研究采用超薄切片法，而超薄切片對植物組織的要求較高，陽春砂的葉片質(zhì)地結(jié)構(gòu)緊密，切成的超薄切片容易產(chǎn)生褶皺，影響觀察效果。制作半薄切片時不易得到完整的葉片橫切面，且葉片表面革質(zhì)，用指甲油印痕法制片印痕效果不佳，拍照后圖片不夠清晰。此外，其他的一些結(jié)構(gòu)特征未能觀察到，存在局限性，試驗方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。且超薄切片制成的切片較小只能得到部分橫切面，張大鵬等［31］采用冷凍切片法制成的切片觀察效果較好，進(jìn)一步研究時可采用此種方法。

4 小結(jié)

研究表明，陽春砂和草果具備半陰生植物的結(jié)構(gòu)特征，體現(xiàn)出對半陰生環(huán)境的適應(yīng)性。2 種植物雖同屬，大部分結(jié)構(gòu)相似，但還是存在一定的結(jié)構(gòu)差異，這些差異特征較為穩(wěn)定且均是2 種植物長期適應(yīng)林下陰濕環(huán)境的結(jié)果。本研究從電鏡超微觀方面觀察豆蔻屬2 種植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為該屬植物的進(jìn)一步研究提供了一定的解剖依據(jù)，同時為適應(yīng)溫暖濕潤、陰蔽的林下生長的植物提供解剖結(jié)構(gòu)依據(jù)。