張志剛，王開(kāi)梅，吳兆圓，萬(wàn)中義，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，武漢 430064）

在使用化合物或提取物進(jìn)行殺菌活性測(cè)試體系中，活性化合物處于持續(xù)降解中，而病原菌處于持續(xù)增殖的進(jìn)程中，直接使用活性成分進(jìn)行測(cè)試需要較高的濃度才能顯示出穩(wěn)定的活性。因此，提高篩選體系敏感度的常用方法是提取、濃縮。在生防殺菌劑的篩選中，提取和濃縮也只能反映生防菌的部分效果。在瓊脂擴(kuò)散法中使用含有活菌的發(fā)酵液，解決了活性成分濃度持續(xù)降低而靶標(biāo)持續(xù)增殖引起的假陰性難題。樣品菌能保持持續(xù)生長(zhǎng)，活性物質(zhì)總量也保持持續(xù)增長(zhǎng)，解決了活性成分的分解和培養(yǎng)基對(duì)活性成分稀釋的問(wèn)題，且無(wú)需采用提取、濃縮等通用方法，簡(jiǎn)化了篩選流程，也降低了篩選成本。瓊脂擴(kuò)散法為靶標(biāo)病原菌和發(fā)酵液樣品中的活菌（放線(xiàn)菌）同時(shí)提供了持續(xù)生長(zhǎng)的條件。在靶標(biāo)病原菌持續(xù)擴(kuò)增的同時(shí)，發(fā)酵液中的活性成分也在持續(xù)產(chǎn)生。因此，含有活菌的放線(xiàn)菌源樣品中不僅包括代謝產(chǎn)物（活性化合物），而且在測(cè)試的培養(yǎng)過(guò)程中，代謝產(chǎn)物還在持續(xù)產(chǎn)生。所以在使用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)化合物測(cè)試時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，化合物的濃度會(huì)降低，抑菌圈會(huì)縮小或者消失。因此，在對(duì)含有活菌的樣品進(jìn)行測(cè)試時(shí)，影響活性反應(yīng)的因素就更加多樣。使用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)生防殺菌劑樣品進(jìn)行的測(cè)試，更接近生防菌在實(shí)際應(yīng)用中的狀態(tài)。由于靶標(biāo)菌和樣品（含有活菌）都處于動(dòng)態(tài)變化中，為了反映含有活菌發(fā)酵液的真實(shí)活性，減少漏篩，必須對(duì)活性反應(yīng)的影響因子進(jìn)行深入了解，進(jìn)而進(jìn)行合理地調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物病原菌 膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeobosporioides）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜猝倒病菌（Pythium aphanidematum），菌種由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物資源研究室保存，菌株長(zhǎng)期保存條件為-80 ℃，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行活化傳代后用于試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 全營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基粉40 g/L，美國(guó)BD 公司）、半營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖無(wú)瓊脂培養(yǎng)基粉12 g/L，美國(guó)BD 公司；瓊脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、全營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基粉24 g/L，美國(guó)BD 公司）、水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品及測(cè)試用放線(xiàn)菌菌株 標(biāo)準(zhǔn)品有咪鮮胺（Prochloraz，99.5%）、甲霜靈（Metalaxyl，99.7%）；測(cè)試用放線(xiàn)菌菌株有A17815、A22193、A65560，陰性對(duì)照菌株為A50052。

1.1.4 放線(xiàn)菌發(fā)酵液 放線(xiàn)菌發(fā)酵液由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物資源研究室提供。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為HB-M-19：葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉40.0 g/L，玉米粉15.0 g/L，豆餅粉25.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，硫酸銨0.5 g/L，溶于約950 mL 無(wú)菌水中，調(diào)節(jié)pH 7.0，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至1 000 mL。

1.1.5 主要儀器、設(shè)備 臺(tái)式振蕩器、血球計(jì)數(shù)板、移液器、光學(xué)顯微鏡、DH-S10 型手持式組織勻槳機(jī)、手持式紅外測(cè)溫儀、超聲波振蕩器、牛津杯［（外徑×內(nèi)徑×高），7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm］、100 mm×100 mm 方形培養(yǎng)板、恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)（EPPENDORF5418 型）、Millex-GP 0.22 μm 過(guò)濾器、無(wú)菌操作臺(tái)、數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及測(cè)試培養(yǎng)板制備 全營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基、半營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基、全營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基滅菌后備用［1，2］。培養(yǎng)板制備分兩步，第一步制作基層，基層可以用全營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基或者水瓊脂培養(yǎng)基?；鶎优囵B(yǎng)基經(jīng)加熱后移入空白培養(yǎng)板中，加入量為10 mL，靜置冷卻備用。第二步制作病原真菌層，基層培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，把孢子懸浮液或菌絲懸浮液（室溫）與全營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基（40～45 ℃）按1∶1（V∶V）混合成病原菌懸浮培養(yǎng)基，迅速移入第一層基層表面，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使病原菌懸浮培養(yǎng)基均勻、完整地覆蓋基層，靜置、冷卻備用。病原菌培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，在表面加上牛津杯，每個(gè)培養(yǎng)板中加入牛津杯的數(shù)量和相鄰牛津杯間的距離可根據(jù)試驗(yàn)樣品的數(shù)量進(jìn)行調(diào)整，以保證不同樣品形成的抑菌圈不發(fā)生交差重疊為準(zhǔn)。

1.2.2 發(fā)酵液樣品及標(biāo)準(zhǔn)化合物樣品準(zhǔn)備 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，發(fā)酵液或標(biāo)準(zhǔn)化合物的用藥量調(diào)控使用2 種方式［3，4］。一種是使用固定濃度，通過(guò)調(diào)整加樣體積來(lái)控制用藥量；另一種是使用固定加樣體積，把樣品稀釋成不同濃度。發(fā)酵液稀釋為12 個(gè)濃度：100%（F）（發(fā)酵液原液）、50.00%（F）、25.00%（F）、12.50%（F）、6.25%（F）、3.13%（F）、1.56%（F）、0.78%（F）、0.39%（F）、0.20%（F）、0.10%（F）、0.05%（F）。根據(jù)需要把標(biāo)準(zhǔn)化合物配制成合適的濃度。咪鮮胺：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。甲霜靈：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。

1.2.3 供試病原真菌感染液制備 ①灰霉病菌孢子懸浮液制備［5］?；颐共【诎霃綖?5 mm 的平皿中以全營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 周后產(chǎn)生大量真菌孢子。在平皿中加入10 mL 無(wú)菌水，用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)物表面，獲得孢子懸浮液。如果孢子懸浮液中混有少量菌絲，可用雙層滅菌醫(yī)用紗布將菌絲濾除。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。用無(wú)菌水稀釋到試驗(yàn)所需要的濃度，備用。②膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌絲懸浮液制備［6，7］。以全營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)1 周后的純培養(yǎng)物移入高速攪拌機(jī)，以5 000 r/min 的速度攪拌，用無(wú)菌水稀釋到試驗(yàn)所需要的濃度，備用。③西瓜猝倒病菌絲懸浮液制備［8，9］。以全營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)2 d 后的純培養(yǎng)物移入高速攪拌機(jī)，以5 000 r/min的速度攪拌，用無(wú)菌水稀釋到試驗(yàn)所需要的濃度，備用?；颐共【咦討腋∫簼舛葹?0 000 個(gè)孢子/mL，膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌、西瓜猝倒病菌菌絲懸浮液濃度為30 000 個(gè)菌絲/mL［10，11］。

1.2.4 瓊脂擴(kuò)散法中活性反應(yīng)的多樣性

1）活性評(píng)價(jià)指標(biāo)［12］。瓊脂擴(kuò)散法中活性基本表現(xiàn)是在樣品周?chē)纬梢志?，在樣品通量小的情況下，通常直接測(cè)量抑菌圈大?。ò霃?、直徑或面積）來(lái)標(biāo)記活性強(qiáng)度。在高通量篩選中，為了方便統(tǒng)計(jì)，通常以分級(jí)的方式對(duì)活性進(jìn)行記錄。瓊脂擴(kuò)散法中不同樣品的活性反應(yīng)不僅表現(xiàn)在抑菌圈的大小，而且在抑菌圈的邊緣和圈內(nèi)也有不同的活性反應(yīng)。所以在本研究中，用2 個(gè)指標(biāo)來(lái)對(duì)抑菌活性進(jìn)行記錄。指標(biāo)一是直接測(cè)量抑菌圈半徑，指標(biāo)二是不考慮抑菌圈大小，按抑菌圈內(nèi)病原菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)梯度為0、3、7、9。梯度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 表示無(wú)抑菌圈；3 表示抑菌圈內(nèi)菌絲生長(zhǎng)密度比對(duì)照略小，圈內(nèi)菌絲生長(zhǎng)缺損率在30%以下；7 表示抑菌圈內(nèi)菌絲生長(zhǎng)有部分缺損，圈內(nèi)菌絲生長(zhǎng)缺損率為30%～90%；9 表示抑菌圈邊緣清晰，圈內(nèi)菌絲生長(zhǎng)缺損率在90%以上。

2）瓊脂擴(kuò)散法中不同樣品的活性反應(yīng)差異。由于本試驗(yàn)中要加入的樣品為液態(tài)，而且加入樣品體積也不盡相同，為了避免樣品直接加在培養(yǎng)基表面引起樣品擴(kuò)散面積的差異，所以樣品加入牛津杯中。把幾個(gè)測(cè)試菌株的發(fā)酵液配制成不同濃度，按照試驗(yàn)要求把不同體積的藥液移入到“1.2.1”中提前制備的培養(yǎng)基表面的牛津杯中。培養(yǎng)條件：溫度20 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%，黑暗。2 d 后記錄所有抑菌圈半徑（指標(biāo)1）和抑菌圈內(nèi)病原菌生長(zhǎng)情況（指標(biāo)2）。

1.2.5 瓊脂擴(kuò)散法中病原菌菌絲懸浮液處理方法對(duì)活性反應(yīng)的影響試驗(yàn) 瓊脂擴(kuò)散法中靶標(biāo)病原菌菌絲相互交織成網(wǎng)狀，需要進(jìn)行前處理。菌絲的切割處理可能影響菌絲活力。把菌絲通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)的刀片進(jìn)行切割，制成均勻的菌絲懸浮液，以便菌絲能均勻分布在上層固體培養(yǎng)基中，按“1.2.3”中的方法對(duì)膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進(jìn)行切割處理，處理時(shí)長(zhǎng)分別為1、10、60 s。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”的方法制備感染培養(yǎng)基。以標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560 和陰性對(duì)照菌株A50052 作為指示菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560 和陰性對(duì)照菌株A50052 均使用發(fā)酵液，加入樣品量為0.06 mL/孔。培養(yǎng)條件：溫度20 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養(yǎng)2 d 的活性反應(yīng)，記錄抑菌圈形態(tài)和病原菌菌絲覆蓋在培養(yǎng)基表面的狀況。

1.2.6 瓊脂擴(kuò)散法中病原真菌濃度與活性反應(yīng)的影響試驗(yàn) 按“1.2.3”中的方法對(duì)膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進(jìn)行切割處理，處理時(shí)長(zhǎng)分別為60、60、1 s。計(jì)數(shù)各病原菌懸浮液中菌絲濃度，以無(wú)菌水調(diào)整菌絲濃度達(dá)12 000、6 000、3 000、1 500、750 個(gè)/mL。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”中的方法制備感染培養(yǎng)基。感染培養(yǎng)基終濃度分別為60 000、30 000、15 000、7 500、3 750 個(gè)/mL。以標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560 和陰性對(duì)照菌株A50052 作為指示菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560 和陰性對(duì)照菌株A50052 均使用發(fā)酵液，加入樣品量為0.06 mL/孔，重復(fù)3 次。培養(yǎng)條件：溫度20 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養(yǎng)2 d 的活性反應(yīng)，記錄抑菌圈半徑和病原菌菌絲覆蓋在培養(yǎng)基表面的狀況。

1.2.7 瓊脂擴(kuò)散法中樣品處理及樣品加入量與活性反應(yīng)的關(guān)系 按“1.2.3”中的方法對(duì)膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進(jìn)行切割處理，處理時(shí)長(zhǎng)分別為60、60、1 s。計(jì)數(shù)各病原菌懸浮液中菌絲濃度，以無(wú)菌水調(diào)整菌絲濃度達(dá)6 000個(gè)/mL。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”中的方法制備感染培養(yǎng)基。感染培養(yǎng)基終濃度為3 000 個(gè)/mL。以標(biāo)準(zhǔn)菌 株A22139、A65560、A19790 和 陰 性 對(duì) 照 菌 株A50052 作為樣品菌，以咪鮮胺、甲霜靈為標(biāo)準(zhǔn)化合物樣品。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株A22139、A65560、A19790 樣品進(jìn)行如下分類(lèi)和處理：a.發(fā)酵液；b.離心上清液，為發(fā)酵液經(jīng)過(guò)4 000 r/min 速度離心所得上清液；c.過(guò)濾除菌上清液，為發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾除菌體及培養(yǎng)基的濾液；d.濾渣，為發(fā)酵液過(guò)濾后余下的濾渣（含有菌體及培養(yǎng)基），再以無(wú)菌水還原到發(fā)酵液同等體積，重復(fù)操作5 次后所得懸浮液。所有標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品按“1.2.2”中的方法進(jìn)行稀釋。牛津杯中加入樣品量分別為180、90、45、20、10、5、2 μL。重復(fù)3 次。培養(yǎng)條件：溫度20 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養(yǎng)2 d 的活性反應(yīng)，測(cè)量并記錄抑菌圈半徑及抑菌圈形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂擴(kuò)散法中活性反應(yīng)的多樣性

瓊脂擴(kuò)散法中樣品在不同區(qū)域分布不均勻，因此與其他要求樣品均勻分布的生物測(cè)定方法在活性表現(xiàn)方面有獨(dú)特之處。樣品活性受到化合物擴(kuò)散速率及活性特征（抑制或殺滅）的雙重影響。不同的放線(xiàn)菌發(fā)酵液樣品和標(biāo)準(zhǔn)化合物樣品在瓊脂擴(kuò)散法中的活性反應(yīng)具有多樣性。3 個(gè)樣品的測(cè)試濃度如表1 所示，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1a 所示，樣品咪鮮胺（行1）及樣品A22139 形成的抑菌圈外緣呈毛刺狀，而樣品A65560 形成的抑菌圈外緣平整；如圖1b、圖1c 所示，抑菌圈半徑與樣品濃度呈正相關(guān)，但抑菌圈內(nèi)病原菌生長(zhǎng)特征與樣品濃度無(wú)關(guān)。

圖1 三個(gè)樣品的不同濃度與活性反應(yīng)的關(guān)系

表1 三個(gè)樣品的測(cè)試濃度

2.2 瓊脂擴(kuò)散法中靶標(biāo)病原菌菌絲懸浮液處理方法對(duì)試驗(yàn)的影響

標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560 用于顯示抑菌圈的形態(tài)，陰性對(duì)照菌株A50052 用于比較加樣區(qū)域與空白區(qū)域病原菌菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果（圖2）表明，3 種病原菌對(duì)菌絲破碎時(shí)間的反應(yīng)不同。隨著菌絲破碎時(shí)間（1、10、60 s）的延長(zhǎng)，膠孢炭疽病菌和番茄枯萎病菌的生長(zhǎng)狀況更好，培養(yǎng)基表面的菌絲更加均勻；西瓜猝倒病菌則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果，即隨著菌絲破碎時(shí)間（1、10、60 s）的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基表面的菌絲分布越不均勻，缺損越嚴(yán)重。

圖2 不同菌絲破碎時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 瓊脂擴(kuò)散法中靶標(biāo)病原菌濃度與活性反應(yīng)的關(guān)系

混入上層培養(yǎng)基中靶標(biāo)菌的濃度會(huì)直接影響培養(yǎng)過(guò)程中單位面積菌絲的含量。從圖3a、圖3b、圖3c 可以看出，單一濃度（標(biāo)準(zhǔn)菌株A65560）發(fā)酵液，引起的抑菌圈半徑（指標(biāo)1）與混入培養(yǎng)基中靶標(biāo)菌的濃度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)抑菌圈半徑也有上限。由表2 可知，抑菌圈內(nèi)部的靶標(biāo)菌生長(zhǎng)特征（指標(biāo)2）與靶標(biāo)菌在培養(yǎng)基中的濃度不相關(guān)。

圖3 抑菌圈半徑（指標(biāo)1）與培養(yǎng)基中靶標(biāo)菌濃度的關(guān)系

表2 抑菌圈內(nèi)部的靶標(biāo)菌生長(zhǎng)特征（指標(biāo)2）與培養(yǎng)基中靶標(biāo)菌濃度的關(guān)系

2.4 瓊脂擴(kuò)散法中樣品處理及樣品加入量與活性反應(yīng)的關(guān)系

由表3 可知，同一個(gè)樣品作用于同一靶標(biāo)所形成的抑菌圈半徑大小與樣品加入量呈正相關(guān)。含有活菌的發(fā)酵液加入量2～180 μL 都能檢出活性，且活性反應(yīng)強(qiáng)度隨樣品加入量的減少變化不明顯；標(biāo)準(zhǔn)化合物與過(guò)濾除菌的發(fā)酵液引起的活性反應(yīng)相似，僅在幾個(gè)較大樣品加入量時(shí)才能顯示活性，而且隨著樣品加入量的減少，活性反應(yīng)明顯變?nèi)酰话l(fā)酵液比經(jīng)過(guò)離心的上清液（仍然含有活菌）表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，經(jīng)過(guò)離心的上清液比過(guò)濾除菌的上清液也表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，可見(jiàn)活菌的存在可以提高篩選敏感度。

表3 樣品加入量對(duì)抑菌圈半徑（指標(biāo)1）的影響

由表4 可知，同一個(gè)樣品作用于不同靶標(biāo)，形成的抑菌圈形態(tài)不一定相同，但是同一樣品作用于同一靶標(biāo)所形成的抑菌圈形態(tài)完全一致，與樣品加入量無(wú)關(guān)。

表4 樣品加入量與對(duì)抑菌圈形態(tài)（指標(biāo)2）的影響

3 小結(jié)與討論

當(dāng)樣品液加入牛津杯后，一方面，樣品中的殺菌活性化合物以牛津杯為中心向周邊的培養(yǎng)基擴(kuò)散，當(dāng)抑菌化合物接觸到已經(jīng)混在培養(yǎng)基中的靶標(biāo)菌時(shí)，靶標(biāo)菌的菌絲生長(zhǎng)受到抑制，因此形成抑菌圈。抑菌化合物擴(kuò)散的同時(shí)，化合物會(huì)被培養(yǎng)基稀釋。以牛津杯為中心，樣品濃度由內(nèi)向外遞減，對(duì)靶標(biāo)菌的抑制作用也由內(nèi)向外遞減，當(dāng)濃度降到不足以形成對(duì)靶標(biāo)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用時(shí)，就形成了抑菌圈的邊界。隨著時(shí)間的推移，樣品在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散也在持續(xù)，培養(yǎng)基中的化合物濃度一直處于動(dòng)態(tài)變化中。如果樣品不包含活菌，抑菌化合物的濃度會(huì)持續(xù)下降。如果樣品中含有活菌，活菌仍在產(chǎn)生抑菌化合物，則培養(yǎng)基中的抑菌化合物總量會(huì)持續(xù)增加，并且維持著一定的動(dòng)態(tài)平衡。另一方面，當(dāng)靶標(biāo)菌混入培養(yǎng)基后，靶標(biāo)菌的菌絲會(huì)持續(xù)擴(kuò)張生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移，單位面積菌絲含量會(huì)遞增，對(duì)抑菌化合物的反抑制作用增強(qiáng)。菌絲含量和化合物濃度始終處于動(dòng)態(tài)變化中，因此作為這一動(dòng)態(tài)變化的反應(yīng)——抑菌圈的形成必定會(huì)受到這兩方面的綜合影響。同一放線(xiàn)菌菌株的不同樣品類(lèi)型活性大小表現(xiàn)為發(fā)酵液＞離心上清液＞濾渣＞過(guò)濾除菌上清液。直接使用發(fā)酵液進(jìn)行篩選不僅操作簡(jiǎn)便，而且提高了篩選的敏感度。使用含活菌的生防菌樣品的篩選要求生物測(cè)定的培養(yǎng)過(guò)程中，活菌仍然保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)。由于待篩選的大多數(shù)放線(xiàn)菌的適應(yīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件并不相同，所以普篩中采用相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行分批處理發(fā)酵，活性測(cè)試結(jié)果也只需確定活性的有無(wú)。對(duì)于通量要求較大的篩選，初篩可以選擇只使用指標(biāo)2 作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，在復(fù)篩中才使用測(cè)量抑菌圈半徑的指標(biāo)1。相對(duì)于使用化合物或提取物進(jìn)行的殺菌活性篩選，直接使用發(fā)酵液進(jìn)行篩選不僅降低了樣品制備的高成本，而且還提高了篩選的敏感度。使用含有活菌的樣品進(jìn)行的生防菌活性測(cè)試綜合考慮了抑菌活性化合物及活菌的單一和協(xié)作效果，提高了篩選的敏感度。同時(shí)，由于樣品及靶標(biāo)都處于持續(xù)生長(zhǎng)狀態(tài)中，所以影響活性強(qiáng)度的因素也更復(fù)雜，為了提高篩選結(jié)果的穩(wěn)定性，需要根據(jù)不同病原菌靶標(biāo)和樣品特征對(duì)篩選細(xì)節(jié)進(jìn)行調(diào)整［13，14］。此外，感染培養(yǎng)基的混合溫度及基層培養(yǎng)基和含靶標(biāo)菌的上層培養(yǎng)基厚度也對(duì)抑菌圈直徑（指標(biāo)1）有影響，這些影響均可以通過(guò)操作的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行控制。使用牛津杯固定樣品的瓊脂擴(kuò)散法（在樣品量小或者樣品流動(dòng)性不影響試驗(yàn)時(shí)，可以不使用牛津杯）在其他微生物源生防殺菌劑篩選中的優(yōu)勢(shì)有待進(jìn)一步研究。