郭 沖，劉雅潔，楊懿德，楊 洋，楊國(guó)偉，許艷玲，陳佛源，韓 偉，劉 雷，鄢 敏，曾淑華

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2.四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644600）

地膜覆蓋可有效提高地溫、保蓄水土、減少養(yǎng)分流失、促進(jìn)移栽植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育，是農(nóng)作物重要的栽培措施之一。研究表明，烤煙地膜覆蓋有利于土壤微生物的聚集，能顯著增加土壤微生物的數(shù)量［1-3］。但這些研究均局限于土壤微生物的數(shù)量，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度及優(yōu)勢(shì)菌群等的研究并不深入。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)已成為當(dāng)前研究環(huán)境微生物種群動(dòng)態(tài)的有力工具，高通量測(cè)序技術(shù)可以避開(kāi)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，能較全面地對(duì)生境中的微生物總DNA 進(jìn)行分析，靈敏、快速地檢測(cè)環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，從而獲得復(fù)雜生境中微生物種群變化的準(zhǔn)確信息［4-6］。

有研究表明，在高海拔煙區(qū)，全生育期地膜覆蓋能顯著提高烤煙產(chǎn)值和產(chǎn)量，對(duì)烤煙化學(xué)品質(zhì)也有一定影響［7，8］。相較于常規(guī)烤煙生產(chǎn)的揭膜栽培，全生育期覆膜會(huì)顯著改變土壤生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，但目前關(guān)于全生育期覆膜栽培對(duì)植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。真菌是土壤中常見(jiàn)的微生物之一，與其他微生物一起參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)，包括碳、氮、磷、硫等的循環(huán)，為植物提供營(yíng)養(yǎng)［9，10］，但同時(shí)真菌也是引起很多土傳病害的重要因素［11，12］，影響烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育［13］。本研究利用ITS測(cè)序技術(shù)，分析土壤真菌類(lèi)群對(duì)植煙全生育期地膜覆蓋的響應(yīng)，同時(shí)結(jié)合土壤理化性質(zhì)綜合分析土壤環(huán)境的變化，旨在為植煙全生育期地膜覆蓋栽培技術(shù)的進(jìn)一步推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在四川省宜賓市興文縣仙峰苗族鄉(xiāng)群魚(yú)社區(qū)（28°04′—28°27′N(xiāo)，104°52′—105°21′E，海拔1 153.6 m）。供試土壤為沙壤土，10～20 cm 土層pH 為5.45，含有機(jī)質(zhì)51.10 g/kg、全氮1.09 g/kg、堿解氮188.77 mg/kg、全磷1.67 g/kg、有效磷24.41 mg/kg、全鉀88.15 g/kg、速效鉀14.50 mg/kg。

試驗(yàn)選用的烤煙品種為云煙87，氮、磷、鉀施用比例為N∶P2O5∶K2O=1.0∶1.4∶3.7。試驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)對(duì)照（CK，白色地膜覆蓋，并于移栽后55 d 揭膜）和3個(gè)處理，3 個(gè)處理分別為黑色地膜（HN）、白色地膜（BN）、黑白雙色地膜（SN）全生育期覆蓋。小區(qū)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)小區(qū)種煙100 株，種植密度為16 500 株/hm2。

1.2 土樣采集

在煙地施肥前，根據(jù)五點(diǎn)取樣法采集土樣測(cè)定試驗(yàn)地土壤基本理化性質(zhì)。在旺長(zhǎng)前期（揭膜時(shí)）、成熟期利用五點(diǎn)取樣法采集10～20 cm 土層的土樣。將5 個(gè)點(diǎn)的土樣混勻，去除石子及植物殘?bào)w，裝入樣品袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于室內(nèi)風(fēng)干48 h、研磨、過(guò)篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。此外，最后一次取樣（成熟期）時(shí)將樣品分為兩份，一份利用液氮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱，用于真菌ITS 測(cè)序分析，另一份同之前取樣操作相同。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及分析方法

1.3.1 真菌ITS 測(cè)序與信息分析

1）微生物總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序。采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒方法，稱(chēng)取土壤樣品0.5 g，按照試劑盒操作說(shuō)明提取微生物總DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行定量。使用引物ITS1FI2（5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′）和ITS2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［14］對(duì) 真菌（ITS2）可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit 回收試劑盒。純化后的PCR 產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在Qbit 熒光定量系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)濃度應(yīng)在2 nmol/L 以上。將合格的上機(jī)測(cè)序文庫(kù)（Index 序列不可重復(fù)）梯度稀釋后，根據(jù)所需測(cè)序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH 變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，使用NovaSeq 測(cè)序儀進(jìn)行2×250 bp 的雙端測(cè)序。

2）生物信息學(xué)分析。根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)，采用Pear 將R1、R2 序列拼接成長(zhǎng)的tag 序列，并使用cutadapter 去除barcode 以及引物序列。然后采用Fqtrim 過(guò)濾低質(zhì)量序列，采用Vsearch（v2.3.4）過(guò)濾嵌合體。使用DADA2 進(jìn)行降噪后，得到特征表和特征序列。α 多樣性通過(guò)抽平（將所有樣本的序列數(shù)抽取至最少序列樣本的序列數(shù)）的方式進(jìn)行歸一化，物種注釋使用相對(duì)豐度進(jìn)行歸一化處理（X菌群count/總count）。α 多樣性由QIIME2 流程分析，圖片由R（v3.5.2）包繪制。物種注釋采用QIIME2 的插件feature-classifier進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA和unite 數(shù)據(jù)庫(kù)，以SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤溫度按氣象學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)小區(qū)根據(jù)五點(diǎn)取樣法，安置5 支地溫計(jì)（創(chuàng)紀(jì)美CJM-367），在對(duì)照揭膜后每隔5 d 測(cè)1 次溫度，每天的測(cè)溫時(shí)間為8：00、14：00、20：00，按T=（2T14：00+T8：00+T20：00）/4 計(jì) 算 平 均 地 溫，T表 示 土 壤 溫度，下標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)。土壤質(zhì)量含水率利用烘干稱(chēng)重法測(cè)定，在揭膜后10、20、30、40、50 d 取樣。土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀、全銅、全鋅、全鐵、氯、全硫、全鈣、有效鎂、有效銅、有效鋅、有效鐵、全硼等理化指標(biāo)的測(cè)定參照文獻(xiàn)［15，16］。

1.3.3 烤煙經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查 按照GB 2635—1992 對(duì)初烤煙葉進(jìn)行分級(jí)［17］，并記錄上、中、下等級(jí)煙葉的質(zhì)量，按照當(dāng)?shù)厥召?gòu)價(jià)計(jì)算均價(jià)和產(chǎn)值。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 軟件、Canoco（4.5）軟件、R 語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件、SPSS 24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用Duncan’s 新復(fù)極差法、皮爾遜積差相關(guān)進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較和相關(guān)性分析。分類(lèi)操作單元（OTU）被定義為一組具有相同限制條件的序列。采用QIIME［18］方法估算真菌多樣性指數(shù)，其中，OTUs、Chao1 指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息；樣本覆蓋率反映樣本低豐度特征值覆蓋情況；Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)分別反映物種的豐富度和均勻度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顏色地膜全生育期覆蓋對(duì)烤煙經(jīng)濟(jì)性狀的影響

由表1 可知，不同顏色地膜全生育期覆蓋處理的產(chǎn)量和產(chǎn)值都顯著優(yōu)于對(duì)照（P＜0.05）。產(chǎn)量上，黑白雙色、黑色、白色地膜全生育期覆蓋處理分別比對(duì)照增產(chǎn)13.33%、18.24%、21.36%；產(chǎn)值上，黑白雙色、黑色、白色地膜全生育期覆蓋處理分別比對(duì)照增值20.26%、15.87%、13.28%。在產(chǎn)值、均價(jià)、中上等煙比例上，不同處理之間均存在顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明不同顏色地膜覆蓋栽培對(duì)烤煙經(jīng)濟(jì)性狀具有重要影響。綜合來(lái)看，黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理優(yōu)于白色和黑色地膜全生育期覆蓋處理。

表1 不同顏色地膜覆蓋對(duì)烤煙經(jīng)濟(jì)性狀的影響

2.2 不同顏色地膜全生育期覆蓋對(duì)植煙土壤理化性質(zhì)的影響

2.2.1 植煙土壤溫度的差異 由表2 可知，與對(duì)照相比，3 種顏色的地膜全生育期覆蓋均能在一定程度提高植煙土壤的平均溫度，平均增溫效果表現(xiàn)為白色地膜＞黑白雙色地膜＞黑色地膜，分別增溫1.32、0.95、0.53 ℃。此外，白色地膜和黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理各測(cè)定時(shí)間的平均溫度均高于對(duì)照（除5、60 d 時(shí)的SN），而黑色地膜全生育期覆蓋處理在揭膜初期（5、10 d 和15 d）的土壤溫度低于對(duì)照，后期（除40 d 外）則均高于對(duì)照，這可能是揭膜初期氣候溫度整體不高導(dǎo)致的。

表2 揭膜后不同處理土壤溫度差異

2.2.2 植煙土壤質(zhì)量含水率的差異 圖1A、1B、1C 分別為植煙土壤3 個(gè)不同耕層深度（0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm）在揭膜后不同時(shí)間土壤質(zhì)量含水率的變化，圖1D 為揭膜后各處理和對(duì)照5 次取樣平均含水率的差異。隨著土壤耕層深度的增加，各處理和對(duì)照土壤質(zhì)量含水率整體呈增加趨勢(shì)。在土壤表層（0～10 cm），除了黑色地膜全生育期覆蓋處理在揭膜后30 d 和40 d 土壤質(zhì)量含水率略高于對(duì)照外，其他處理土壤質(zhì)量含水率均低于對(duì)照（圖1A）；在土壤中層（10～20 cm），白色地膜和黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理土壤質(zhì)量含水率整體大于對(duì)照，黑色地膜全生育期覆蓋處理則低于對(duì)照（圖1B）；在土壤深層（20～30 cm），僅白色地膜全生育期覆蓋處理土壤質(zhì)量含水率高于對(duì)照，黑色地膜和黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理都低于對(duì)照（圖1C）。結(jié)合各處理和對(duì)照5 次土壤質(zhì)量含水率的平均值（圖1D）來(lái)看，全生育期覆膜處理在土壤表層對(duì)植煙土壤的保水性不如對(duì)照，在土壤中層白色地膜和黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理的保水性均優(yōu)于對(duì)照，在土壤深層只有白色地膜全生育期覆蓋處理的保水性?xún)?yōu)于對(duì)照。這可能是由于不同顏色地膜覆蓋下土壤溫度存在差異，導(dǎo)致土壤水分的蒸發(fā)量不一致。

圖1 不同顏色地膜覆蓋土壤質(zhì)量含水率的差異

2.2.3 其他理化性質(zhì)的差異 如表3 所示，各處理土壤理化性質(zhì)差異顯著。對(duì)照的堿解氮含量顯著高于其他全生育期覆膜處理（P＜0.05），但全磷、速效鉀含量最低，且全磷含量與其他處理差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明中期揭膜處理有利于土壤堿解氮增加，但不利于磷素和速效鉀的富集；白色地膜全生育期覆蓋處理的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷含量顯著低于對(duì)照（P＜0.05），而黑白雙色地膜、黑色地膜全生育期覆蓋處理的這些指標(biāo)含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05），說(shuō)明白色地膜全生育期覆蓋較對(duì)照更有利于煙株對(duì)有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷等養(yǎng)分的吸收，黑白雙色地膜及黑色地膜全生育期覆蓋對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷等養(yǎng)分的消耗效果不如對(duì)照。對(duì)照的pH 及全銅、全鋅、有效鐵的含量高于各全生育期覆膜處理，有效鎂、有效銅、有效鋅和全鐵含量低于各全生育期覆膜處理，說(shuō)明中期揭膜能避免土壤酸化，不利于土壤中全銅、全鋅和有效鐵富集，但有利于煙株對(duì)鎂、有效銅、有效鋅和全鐵的吸收。白色地膜全生育期覆蓋處理全硼含量顯著高于其他處理（P＜0.05），全硫和全鈣含量顯著低于其他處理（P＜0.05），說(shuō)明白色地膜全生育期覆蓋有利于土壤硼素富集，但不利于土壤硫和鈣的積累。

表3 不同顏色地膜覆蓋對(duì)成熟期植煙土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 不同顏色地膜覆蓋對(duì)植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 真菌群落結(jié)構(gòu)的α 多樣性分析 α 多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，主要通過(guò)OTUs、樣本覆蓋率、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simp-son 指數(shù)等反映物種豐富度和均勻度以及測(cè)序深度。OTUs、Chao1 指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息；樣本覆蓋率反映樣本低豐度特征值覆蓋情況；Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)分別反映物種的豐富度和均勻度。從表4 可以看出，全生育期不同地膜覆蓋與對(duì)照之間，植煙土壤真菌的豐富度和均勻度沒(méi)有顯著差異。各處理Shannon 指數(shù)均高于99.00%，樣本覆蓋率均高于91.00%，能夠較為準(zhǔn)確地反映樣本的真實(shí)情況。其中，OTUs 和Chao 1 指數(shù)均表現(xiàn)為SN＞BN＞CK＞HN，SN 處 理 的OTUs、Chao1 指 數(shù)、Simpson 指數(shù)在各處理中均為最高，Shannon 指數(shù)也較高，說(shuō)明黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理的真菌多樣性和豐富度最好。

表4 不同顏色地膜覆蓋對(duì)植煙土壤真菌多樣性的影響

2.3.2 門(mén)水平真菌群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本或分組在門(mén)（Phylum）分類(lèi)水平上最大豐度排名前14 的物種，生成物種相對(duì)豐度柱狀堆疊圖，以便直觀查看各分組在不同分類(lèi)水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例。由圖2 可知，各處理中相對(duì)豐度排名前三的菌門(mén)占總菌門(mén)數(shù)量的83%以上。第一大真菌類(lèi)群為子囊菌門(mén)（Ascomycota），在各處理土壤樣品中均占真菌豐度的44%以上，在對(duì)照中占比最高，說(shuō)明全生育期覆膜會(huì)在不同程度上抑制子囊菌門(mén)豐度的增加，且抑制效果表現(xiàn)為SN＞BN＞HN。第二大類(lèi)群為擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），在各處理土壤樣品中占真菌數(shù)量的比例在19%以上，在對(duì)照中占比最小，說(shuō)明全生育期覆膜能促進(jìn)擔(dān)子菌門(mén)真菌的生長(zhǎng)，且促進(jìn)效果表現(xiàn)為SN＞BN＞HN。第三大類(lèi)群為接合菌門(mén)（Zygomycota），在各處理土壤樣品中平均占真菌總數(shù)量的12%左右，在對(duì)照中占比最少，說(shuō)明全生育期覆膜能促進(jìn)接合菌門(mén)的生長(zhǎng)，且促進(jìn)效果表現(xiàn)為SN＞HN＞BN。綜合來(lái)看，各全生育期覆膜處理對(duì)門(mén)水平上真菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響效果表現(xiàn)為SN＞BN＞HN。

圖2 各樣本門(mén)水平上真菌的相對(duì)豐度

2.3.3 屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分析 在真菌屬水平上，將各分類(lèi)水平相對(duì)豐度最高的30 個(gè)群落組成數(shù)據(jù)依照分類(lèi)單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類(lèi)，根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果對(duì)分類(lèi)單元和樣本分別排序，并通過(guò)熱圖（圖3）加以呈現(xiàn)。聚類(lèi)可以將高豐度和低豐度的分類(lèi)單元加以區(qū)分，并以顏色梯度及相似程度反映多個(gè)樣品在各分類(lèi)水平上組成的相似性和差異性。從圖3 可以看出，黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為被孢霉屬（Mortierella）、枝角菌屬（Cladorrhinum）、松果體屬（Conlarium）、小菇屬（Mycena）和隱球菌屬（Cryptococcus）；白色地膜全生育期覆蓋處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為Rhizophagus、叢赤殼屬（Nectria）；黑色地膜全生育期覆蓋處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium）、蓋型子囊屬（Pseudaleuria）、角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）、癬囊腔屬（Plectosphaerella）、錐梗孢屬（Dissoconium）和小球菌屬（Mycosphaerella）；CK 的優(yōu)勢(shì)菌屬為白鬼傘屬（Leucocoprinus）、黑輪枝屬（Gibellulopsis）、白粉菌屬（Erysiphe）、紅酵母屬（Rhodotorula）、線蟲(chóng)草屬（Ophiocordyceps）和肉座菌屬（Hypocrea）。

圖3 不同處理植煙土壤真菌群落屬水平的層次聚類(lèi)熱圖

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 土壤真菌與α 多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析 將各樣本相對(duì)豐度排名前30 的菌屬與α 多樣性指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果如表5 所示。從表5 可以看出，隱球菌屬（Cryptococcus）、外小杯菌屬（Exophiala）的相對(duì)豐度與OTUs 及Chao1 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；隱球菌屬（Cryptococcus）、外小杯菌屬（Exophiala）、枝角菌屬（Cladorrhinum）的相對(duì)豐度與Shannon 指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；被孢霉屬（Mortierella）的相對(duì)豐度與Simpson 指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），肉座菌屬（Hypocrea）的相對(duì)豐度與Simpson 指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；紅酵母屬（Rhodotorula）的相對(duì)豐度與樣本覆蓋率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 土壤真菌相對(duì)豐度與α 多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析

2.4.2 土壤真菌與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析 將各樣本相對(duì)豐度排名前30 的菌屬與7 項(xiàng)土壤理化性質(zhì)做相關(guān)性分析，篩選與土壤基本理化性質(zhì)存在相關(guān)性的菌屬，如表6 所示。植煙土壤氮、磷含量與肉座菌屬（Hypocrea）、角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、叢赤殼屬（Nectria）的相對(duì)豐度有密切聯(lián)系。其中，肉座菌屬的相對(duì)豐度與全磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），角擔(dān)菌屬的相對(duì)豐度與全氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），鐮刀菌屬的相對(duì)豐度與全氮含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），叢赤殼屬的相對(duì)豐度與有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表6 土壤真菌相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

2.5 土壤理化性質(zhì)與真菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析

選取不同覆膜處理土壤真菌主要門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度前10 的數(shù)據(jù)進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA），結(jié)果顯示4 個(gè)軸中梯度最大值為0.772 0＜3，為此，適合進(jìn)行冗余分析（RDA）。如圖4 所示，植煙土壤中大量元素可以解釋不同處理間43.71% 的變異，RDA1、RDA2 分別為24.13%和19.58%；植煙土壤中量、微量元素可以解釋不同處理間46.31%的變異，RDA1、RDA2 分別為24.80%和21.51%。理化性質(zhì)中，大量元素（全氮、堿解氮、有效磷、全磷、全鉀），中量、微量元素（全硫、全銅、有效銅、全鋅、有效鎂、全硼）是對(duì)植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)起主導(dǎo)作用的影響因素，而溫度、有機(jī)質(zhì)、速效鉀、質(zhì)量含水率、鐵元素、有效鋅、氯元素對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對(duì)較小。

圖4 真菌門(mén)水平相對(duì)豐度和土壤基本理化性質(zhì)（A）及中量、微量元素（B）的冗余分析

從圖4 可以看出，大量元素有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀、全磷、有效磷與Zoopagomycota、Chytridiomycota（壺菌門(mén)）、接合菌門(mén)以及處理HN、SN三者間存在較緊密的正相關(guān)關(guān)系；堿解氮、速效鉀與子囊菌門(mén)、Mucoromycota（毛霉菌門(mén)）以及對(duì)照（CK）三者存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖4A）。中量、微量元素全銅、有效鐵、全鋅、氯元素、全硼與毛霉菌門(mén)、Mortierellomycota（被孢霉門(mén)）、子囊菌門(mén)以及對(duì)照三者間存在較緊密的正相關(guān)關(guān)系。全鈣、全硫、有效銅、有效鋅、全鐵與擔(dān)子菌門(mén)、Zoopagomycota、接合菌門(mén)、Rozellomycota、Olpidiopsis（囊壺菌門(mén)）以及SN 三者間存在較明顯的正相關(guān)趨勢(shì)。全鈣、全硫與Chytridiomycota（壺菌門(mén)）、擔(dān)子菌門(mén)以及HN三者間具有較明顯的正相關(guān)趨勢(shì)（圖4B）。

3 討論

3.1 全生育期不同顏色地膜覆蓋對(duì)植煙土壤養(yǎng)分的影響

大量研究表明，地膜覆蓋會(huì)顯著影響植煙土壤溫濕度、酶活性、養(yǎng)分含量、通透性、微生物等方面，進(jìn)而影響煙株的生長(zhǎng)發(fā)育［19-21］。陳軍［22］的研究認(rèn)為地膜覆蓋栽培會(huì)促進(jìn)煙株早發(fā)快長(zhǎng)，縮短生育期，且有利于煙株早期對(duì)氮素等養(yǎng)分的吸收。本研究從成熟期植煙土壤養(yǎng)分含量角度出發(fā)，測(cè)定了烤煙成熟采烤時(shí)植煙土壤養(yǎng)分含量，發(fā)現(xiàn)對(duì)照堿解氮、全銅、全鋅和有效鐵含量高于各全生育期覆膜處理，全磷、速效鉀、有效鎂、有效銅、有效鋅和全鐵含量低于各全生育期覆膜處理，說(shuō)明中期揭膜有利于全磷、速效鉀、有效鎂、有效銅、有效鋅和全鐵含量的消耗，但由于對(duì)照中期揭膜，土壤養(yǎng)分可能隨水土流失而消耗，因此不能明確對(duì)照消耗的養(yǎng)分是被煙株吸收還是隨水土流失而消耗，后續(xù)還需深入研究。

3.2 全生育期不同顏色地膜覆蓋對(duì)真菌群落多樣性的影響

土壤微生物是土壤中最活躍的生物體，對(duì)土壤環(huán)境變化敏感，在一定程度上反映了土壤質(zhì)量和生態(tài)功能的變化，其多樣性與群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是評(píng)判土壤生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指標(biāo)［23］。大量研究表明，提高土壤微生物多樣性有利于增強(qiáng)植物自身的抗性［24，25］，降低煙田病害的發(fā)生率［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，黑白雙色地膜和白色地膜全生育期覆蓋處理的真菌多樣性較好，對(duì)照次之，黑色地膜全生育期覆蓋最差，但經(jīng)濟(jì)性狀上卻是黑白雙色地膜較好，白色地膜和對(duì)照較差。在中上等煙比例上，白色地膜全生育期覆蓋的優(yōu)質(zhì)煙最少，這極有可能是白色地膜覆蓋導(dǎo)致土壤溫度過(guò)高而影響了煙葉內(nèi)部化學(xué)品質(zhì)的形成。還有研究發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中黑色地膜覆蓋下的優(yōu)勢(shì)鐮刀菌屬，其茄病鐮刀菌（F.solani）和層出鐮刀菌（F.proliferatum）是烤煙鐮刀菌根腐病的主要致病菌［27，28］，對(duì)照中優(yōu)勢(shì)的白粉菌屬（Erysiphe）是煙草白粉病的主要病原菌，但本研究未對(duì)全生育期地膜覆蓋條件下各種病菌的相對(duì)豐度與烤煙病害發(fā)病率展開(kāi)研究。

3.3 植煙土壤理化性質(zhì)與真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切，例如養(yǎng)分、pH、水分、通氣狀況等的改變，都可能引起一些微生物群體快速繁殖成為優(yōu)勢(shì)群落，引起群落結(jié)構(gòu)的變化［29］。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH 是控制土壤微生物多樣性和群落組成的關(guān)鍵因子，并指出pH 對(duì)微生物的分布存在影響［30-32］。有研究表明，土壤速效磷是影響真菌多樣性最主要的土壤因子［33-35，29］，這與本研究發(fā)現(xiàn)大量元素有效磷是植煙土壤真菌主要影響因子之一是一致的。還有研究認(rèn)為土壤速效鉀對(duì)真菌群落多樣性影響較大［36］，這與本研究發(fā)現(xiàn)速效鉀對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小存在矛盾，作者認(rèn)為這主要是受取樣土壤和施肥方式差異的影響所導(dǎo)致。此外，本試驗(yàn)還找到了其他影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子，如全氮、堿解氮、有效硫等。韋俊等［37］的研究認(rèn)為，Chao1 指數(shù)和速效氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Simpson 指數(shù)和全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Chao1 指數(shù)與pH呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明土壤中氮含量過(guò)高會(huì)顯著降低真菌群落多樣性指數(shù)，使真菌偏向性富集。但本研究對(duì)植煙土壤理化性質(zhì)與真菌多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，這可能與全生育期地膜覆蓋栽培方式對(duì)植煙土壤真菌的生境造成較大改變有關(guān)。本研究表明，肉座菌屬相對(duì)豐度與全磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），角擔(dān)菌屬相對(duì)豐度與全氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），鐮刀菌屬相對(duì)豐度與全氮含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），叢赤殼屬相對(duì)豐度與有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。這說(shuō)明不同地區(qū)的氣候、土壤條件及栽培措施都可能使該地植煙土壤真菌結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。因此，要全面了解不同環(huán)境條件下烤煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其影響因素，還有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

在宜賓市高海拔煙區(qū)，全生育期覆膜有利于烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值的提高。與對(duì)照相比，全生育期覆膜會(huì)顯著改變植煙土壤的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。不同覆膜處理植煙土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異，白色地膜全生育期覆蓋和黑白雙色地膜全生育期覆蓋處理的群落結(jié)構(gòu)更相近，黑色地膜全生育期覆蓋和對(duì)照的群落結(jié)構(gòu)更相近。通過(guò)對(duì)全生育期覆膜條件下植煙土壤理化性質(zhì)和真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)、冗余分析，可以明確與真菌緊密相關(guān)的環(huán)境因子，也可以為日后高海拔煙區(qū)全生育期覆膜栽培技術(shù)的推廣提供一定的理論依據(jù)。