何圣科,蒲江漢,馮海玲,吳大平,陳綿軍,陳 輝

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,是全球第五大常見的惡性腫瘤之一,高居癌癥相關(guān)死因的第二位[1]。目前,HCC的病因和發(fā)生機(jī)制尚未完全明確,其遺傳異質(zhì)性強(qiáng),腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及到多基因、多步驟、多環(huán)節(jié)的改變和相互作用。相關(guān)基因水平和功能也在HCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[2,3]。同源盒基因C9(homeobox C9,HOXC9)是HOX基因家族成員,其包含參與脊椎動物胚胎發(fā)育的同源結(jié)構(gòu)域,在胚胎的前-后軸形成過程中起到重要的作用[4]。目前已有報道顯示,在胃癌和肺癌等多種腫瘤均存在HOXC9異常表達(dá)。HOXC9異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[5-7]。驅(qū)動蛋白家族成員4A(kinesin family member 4A,KIF4A)是參與染色體的凝集和分離、紡錘體形成和細(xì)胞內(nèi)大分子運(yùn)輸?shù)壬磉^程的驅(qū)動蛋白超家族成員。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)KIF4A表達(dá)失調(diào)參與了乳腺癌和肺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8,9]。各種腫瘤組織HOXC9和KIF4A表達(dá)異?，F(xiàn)象已引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。本研究采用免疫組化法檢測了HCC組織HOXC9和KIF4A蛋白表達(dá)情況,并分析了它們與腫瘤病理學(xué)特征和臨床預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年1月～2021年1月我院診治的HCC患者86例,男性58例,女性28例;年齡為48～69歲,平均年齡為(57.4±6.9)歲。HCC的診斷參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[10]的標(biāo)準(zhǔn),均經(jīng)影像學(xué)檢查和術(shù)后組織病理學(xué)檢查診斷為HCC。其中,單發(fā)病灶36例,多發(fā)病灶50例;TNM Ⅰa/Ⅱa期46例,Ⅱb/Ⅲb期40例;在顯微鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)有癌細(xì)胞巢團(tuán),即微血管浸潤者37例,無微血管侵犯49例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無法耐受手術(shù)治療;(2)存在其他類型的肝癌或合并其他惡性腫瘤;(3)術(shù)前接受過放療、化療或免疫治療;(4)有肝移植手術(shù)史;(5)存在人類免疫缺陷病毒感染;(6)存在心、腦、肺、腎等重要臟器功能障礙。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員審核,批準(zhǔn)實(shí)施。患者簽署知情同意書。

1.2 手術(shù)方法 根據(jù)腫瘤大小、數(shù)目、部位和分期,選擇行肝葉、肝段、半肝和局部切除術(shù)治療。無菌取癌組織和癌旁肝組織,置于-80℃冰箱凍存。

1.3 癌組織和癌旁肝組織HOXC9和KIF4A蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法檢測。取組織,加二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,再置于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中高溫修復(fù)抗原12 min,冷卻5 min;經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌,滴加3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25 min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;用PBS緩沖液洗滌,加入山羊血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn),再分別加入稀釋后的兔抗人HOXC9多克隆抗體(美國Abcam,1：200稀釋)或兔抗人 KIF4A多克隆抗體(美國Abcam,1：150稀釋),4 ℃下孵育過夜;次日,經(jīng)PBS 緩沖液洗滌,加入酶標(biāo)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司),37℃下孵育30 min;加入二氨基聯(lián)苯胺(北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司)顯色,自來水沖洗,蒸餾水沖洗,用蘇木素復(fù)染,再用PBS緩沖液洗滌、返藍(lán),常規(guī)脫水透明,用中性樹膠封片。以PBS緩沖液或已知陽性切片,分別作為陰性或陽性對照。在200倍顯微鏡下觀察整張切片,隨機(jī)選擇每張切片的5個視野,每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評分,陽性細(xì)胞百分比計分為無(0分)、<25%(1分)、25%～50%(2分)、>50%(3分);無著色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。上述2項(xiàng)評分的乘積<3為低表達(dá),≥3為高表達(dá)。

1.4 隨訪 通過門診復(fù)診或電話隨訪2年。第1年每3個月隨訪1次,第2年每6個月隨訪1次。隨訪終點(diǎn)為患者全因死亡或截至到2023年1月,記錄生存情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用R 4.1.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對計量資料先行Shapiro-Wilk檢驗(yàn),判斷是否服從正態(tài)分布。對非正態(tài)分布者,以M (P25,P75)表示,采用秩和檢驗(yàn)。計數(shù)資料以%表示,采用x2檢驗(yàn)或Fishers確切概率計算。應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線,采用Log Rank檢驗(yàn)比較累積生存率?？尚艆^(qū)間為95%,所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者癌組織與癌旁肝組織HOXC9和KIF4A蛋白陽性率比較 HCC癌組織HOXC和KIF4A高表達(dá)陽性率均顯著高于癌旁肝組織(P<0.05,表1,圖1、圖2)。

表1 HCC患者癌組織與癌旁組織HOXC9和KIF4A陽性率(%)比較

圖1 HCC患者肝組織HOXC9蛋白表達(dá)(ABC, 200×)左：癌旁肝組織;右：癌組織

圖2 HCC患者肝組織KIF4A蛋白表達(dá)(ABC, 200×)左：癌旁肝組織;右：癌組織

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達(dá)陽性率比較 腫瘤低分化和中分化、TNM Ⅱb/Ⅲb期、腫瘤包膜侵犯和發(fā)生微血管浸潤的癌組織HOXC9和KIF4A高表達(dá)陽性率均顯著高于高分化、TNM Ⅰa/Ⅱa期、無腫瘤包膜侵犯或無血管浸潤的癌組織表達(dá)(P<0.05,表2)。

表2 不同臨床和病理學(xué)特征的癌組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達(dá)(%)比較

2.3 HCC癌組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者生存情況比較 術(shù)后隨訪2年,86例患者生存38例(44.2%),死亡48例(55.8%);Log-rank分析顯示,癌組織HOXC9蛋白高表達(dá)患者生存期顯著短于低表達(dá)患者,癌組織KIF4A蛋白高表達(dá)患者生存期也顯著短于KIF4A蛋白低表達(dá)患者(P<0.05,表3,圖3)。

表3 癌組織蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者生存時間[M(P25,P75)]比較

圖3 HCC癌組織蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者生存時間比較左：HOXC9蛋白;右：KIF4A蛋白

3 討論

HOXC9是具有高度保守性的調(diào)節(jié)基因,可控制胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和生長發(fā)育,其表達(dá)異常能夠促進(jìn)侵襲性腫瘤的DNA修復(fù)、侵襲、遷移、誘導(dǎo)血管生成等特征,在腫瘤細(xì)胞異常增殖、形成新生腫瘤組織微血管、轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[11-14]。已有報道[15-17]顯示,HOXC9表達(dá)上調(diào)可通過調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。沉默HOXC9能夠賦予藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化抗性,即產(chǎn)生抗腫瘤效果。本研究結(jié)果顯示,86例患者HCC癌組織HOXC9高表達(dá)陽性率為69.8%,較癌旁肝組織15.1%更高,提示HOXC9在HCC顯示為癌基因,可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。KOXC9在甲狀腺癌顯示為抑癌基因,其低表達(dá)與甲狀腺癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。由此可見HOXC9在不同腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用并不一致,具體機(jī)制仍有待探究。在不同分化程度、不同TNM分期、有無腫瘤包膜侵犯和有無微血管侵犯的HCC患者HOXC9高表達(dá)陽性率不同。本研究經(jīng)生存分析顯示,HCC癌組織HOXC9蛋白高表達(dá)患者生存期顯著短于HOXC9蛋白低表達(dá)患者,提示HOXC9蛋白高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān),與既往報道[18]結(jié)直腸癌HOXC9過表達(dá)提示預(yù)后不良的結(jié)果類似。

KIF4A是參與有絲分裂和胞質(zhì)分裂過程的馬達(dá)驅(qū)動蛋白家族成員,在有絲分裂過程中染色體凝聚和分離的調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用,其異常表達(dá)與有絲分裂異常和非整倍體細(xì)胞的形成有關(guān)[19]?；赨ALCAN 在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),CDCA5、KIF4A、TPX2和FOXM1過表達(dá)共同調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展。叉頭框蛋白M1(fork head box protein M1,FOXM1)作為增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤組織表達(dá)上調(diào),HCC的發(fā)生發(fā)展存在FOXM1-KIF4A軸作用,FOXM1過表達(dá)能夠調(diào)控下游靶標(biāo)KIF4A表達(dá)增強(qiáng),從而對癌細(xì)胞增殖、遷移和入侵產(chǎn)生促進(jìn)作用[20]。本研究經(jīng)生存分析顯示,HCC癌組織KIF4A蛋白高表達(dá)患者生存期顯著短于KIF4A蛋白低表達(dá)患者,提示KIF4A蛋白高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),KIF2C/4A/10/11/14/18B/20A/23表達(dá)上調(diào)不僅與HCC的病理學(xué)分級和腫瘤分期有關(guān),還與患者預(yù)后不良有關(guān),提示KIF4A蛋白是否可以作為HCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物,值得進(jìn)一步研究。