張迎迎,魏珂樂,丁 鶴,郭慧杰,崔 軼,王 昳

肝硬化為內(nèi)科常見疾病,病程較長,為多種病因長期反復破壞肝組織功能而誘發(fā)的彌漫性肝損傷[1]。肝硬化存在結(jié)節(jié)性再生和漸進性肝細胞壞死,而炎癥刺激纖維結(jié)締組織增生,導致肝小葉結(jié)構(gòu)變化,肝臟變硬,肝功能損傷。在肝硬化早期,肝功能代償能力較強,臨床癥狀隱匿,而在肝硬化后期則會出現(xiàn)肝功能受損和門靜脈高壓,累及全身系統(tǒng),出現(xiàn)腹水、感染或癌變等表現(xiàn)[2]。自發(fā)性細菌性腹膜炎(SBP)為失代償期肝硬化嚴重的并發(fā)癥之一,主要是由致病菌經(jīng)淋巴系統(tǒng)、腸道、血液進入引起的腹腔感染。SBP與肝病患者終末期高病死率相關[3]。當前,致病菌對抗菌藥物的耐藥性增加,給臨床治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。因此,了解失代償期肝硬化患者病原菌分布及其耐藥特點,探尋引起感染的危險因素,是臨床防治研究的重點。應用抗生素治療可控制或治愈感染,但仍需研究感染的發(fā)生機制,以便做好預防[4,5]。炎癥為機體對外界刺激產(chǎn)生的自身防御反應,一般分為非感染性炎癥和感染性炎癥。在感染發(fā)生時,往往會激起機體自身免疫反應功能,并調(diào)節(jié)體液分子和免疫細胞抵御病原菌的侵襲。從機體炎癥反應著手,有望成為臨床抗感染治療的新方向[6-8]。分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1(mammalian target of rapamycin 1,mTORC1)通路是機體調(diào)節(jié)炎癥反應的重要通路,其中CD36為B型清道夫受體,可在跨膜結(jié)構(gòu)的細胞質(zhì)外環(huán)狀部分介導下結(jié)合特異性受體,誘發(fā)炎癥反應;mTORC1為細胞活動中心協(xié)調(diào)器,可感知激素、氨基酸、生長因子、營養(yǎng)等變化,對細胞存活、分化、生長和增殖進行調(diào)節(jié),其表達水平異常與炎性疾病的發(fā)生相關[9-11]。本研究檢測了失代償期肝硬化并發(fā)SBP患者CD36/mTORC1信號通路表達,并探討了它們的臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年7月～2023年12月我院診治的失代償期肝硬化患者82例,男55例,女27例;年齡為39～76歲,平均年齡為(54.2±6.3)歲。符合失代償期肝硬化的診斷標準[12]和SBP的診斷標準[11],后者即腹水白細胞計數(shù)在250×106/L以上,發(fā)熱、腹部壓痛、反跳痛、對利尿劑治療應答差,腹水細菌培養(yǎng)陽性。其中乙型肝炎肝硬化49例,丙型肝炎肝硬化5例,酒精性肝硬化20例,原發(fā)性膽汁性肝硬化8例。排除標準：(1)癌性、結(jié)核性腹水;(2)近期有腹部手術(shù)史或繼發(fā)性感染;(3)合并全身性感染。

1.2 病原菌檢測 在無菌條件下,抽取腹水10 ml,進行厭氧和需氧菌培養(yǎng),并采用美國臨床實驗室提供的MicroSean Auto-4全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定。

1.3 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、并發(fā)癥、飲酒史、既往SBP發(fā)生史、實驗室指標[總膽紅素(TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate、aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶((alanine aminotransferase,ALT)、國際標準化比值(international normalized ratio,INR)],計算終末期肝病模型(model of end-stage liver disease,MELD)評分。

1.4 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)CD36/mTORC1信號通路水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,PCR)法檢測PBMC CD36/mTORC1信號通路水平。清晨采集空腹肘靜脈血4 mL,加入EDTA抗凝管。采用淋巴細胞分離液分離PBMCs,采用Trizol法提取PBMCs總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,于-20℃保存?zhèn)溆?采用熒光定量PCR試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)和瑞士羅氏公司生產(chǎn)的Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀檢測CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平,引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成,PCR反應體系為20 μL,包括cDNA 1 μL,上下游引物各0.4 μL,2×KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL,加ddH2O補齊。反應條件為：95℃預變性3 min,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s(40 cycles),72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳,采用2-△△Ct計算結(jié)果,每個樣本檢測3次,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離情況 本組發(fā)生SBP者43例(52.4%),分離出病原菌8株(9.8%),其中科氏葡萄球菌和溶血葡萄球菌各1株,大腸埃希菌2株,肺炎克雷伯菌2株和陰溝桿菌2株。

2.2 失代償期肝硬化并發(fā)SBP的單因素分析 SBP組與肝硬化組在既往SBP發(fā)生史、血清總膽紅素、ALB、INR、MELD評分、PBMCs CD36和mTORC1水平方面比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

表1 失代償期肝硬化并發(fā)SBP的單因素分析

2.3 多因素分析 將上述單因素分析具有統(tǒng)計學意義的指標賦值(未列出),并代入Logistic回歸方程,進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,SBP發(fā)生史、血清總膽紅素、ALB、MELD評分及PBMC CD36和mTORC1水平為影響失代償期肝硬化并發(fā)SBP的獨立危險因素(P<0.05,表2)。

表2 影響失代償期肝硬化并發(fā)SBP的多因素分析

3 討論

SBP為失代償期肝硬化最嚴重的并發(fā)癥之一,且發(fā)病機制復雜。當前,研究多認為與患者吞噬細胞功能降低、肝內(nèi)單核-巨噬細胞系統(tǒng)受損和白細胞黏附趨化作用降低有關[13]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,SBP治療得到一定的改善,但仍具有一定的復發(fā)率,且治療難度較大,治愈率較低,嚴重者還可能并發(fā)感染性休克,威脅患者生命健康。SBP起病隱匿,極易誘導其他器官功能衰竭[14,15]。如何降低失代償期肝硬化并發(fā)SBP的發(fā)生風險,已成為臨床亟待解決的問題之一。

SBP相關的感染病原菌特征發(fā)生了明顯的變化。針對失代償期肝硬化并發(fā)SBP患者病原學特點進行有效監(jiān)控是保證臨床合理應用抗菌藥物的重要手段。本研究在43例患者分離出8株感染病原菌,提示失代償期肝硬化并發(fā)SBP患者以革蘭氏陰性菌感染為主[16]?？咕幬锏膹V泛使用不僅會增加細菌的耐藥性,還會在一定程度上改變感染的病原菌譜,需要認真監(jiān)測。

本研究經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),過去感染SBP、血清總膽紅素、ALB和MELD評分為影響失代償期肝硬化并發(fā)SBP的獨立危險因素。高膽紅素血癥是肝功能損傷的最直接的指標,后者功能降低會改變肝臟血管通透性,增加SBP發(fā)生。SBP的發(fā)生也可在一定程度上損傷肝細胞,導致膽紅素居高不下,發(fā)展為惡性循環(huán)[17]。因此,在臨床治療方面可針對性降低膽紅素水平,阻止病情惡化。ALB和MELD評分為反映肝功能的有效指標。MELD評分越高,肝臟儲備功能越差,造成消化道淤血和門體分流,更易出現(xiàn)腹腔感染,增加SBP發(fā)生的機會[18]。臨床醫(yī)生應重點監(jiān)護MELD評分差的患者,早期給予針對性的治療,以減少SBP的發(fā)生。

炎癥反應的本質(zhì)為機體在出現(xiàn)組織損傷及病原微生物入侵后作出的應答反應,其中細胞因子可通過多種信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)機體炎癥反應。常見的病理過程是在機體感染病毒或細菌后會出現(xiàn)炎癥反應,而控制機體炎癥反應具有一定的積極作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)SBP組CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平顯著高于肝硬化組,提示失代償期肝硬化患者在感染SBP后,機體CD36/TORC1通路蛋白表達上調(diào)。CD36為B型清道夫受體,可識別在跨膜結(jié)構(gòu)胞質(zhì)外環(huán)狀結(jié)構(gòu)并結(jié)合特異性配體,誘導機體炎癥反應,抑制機體感染,故在機體感染后其水平顯著升高。mTORC1為細胞活動中心協(xié)調(diào)器,可感知氨基酸、生長因子、激素和營養(yǎng)的變化,調(diào)節(jié)細胞存活、分化、增殖和生長。mTORC1功能異常多與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展相關[20]。CD36/mTORC1參與炎癥反應的調(diào)控,而炎癥多發(fā)生在感染之后,因此推測CD36/mTORC1參與機體感染發(fā)生和發(fā)展。此外,CD36/mTORC1信號通路與機體肝功能水平密切相關,而肝功能異常者出現(xiàn)SBP風險更高。我們推測CD36/mTORC1信號通路可能參與了失代償期肝硬化并發(fā)SBP的發(fā)生和發(fā)展,但仍需進行研究驗證。

綜上所述,血清總膽紅素、ALB、MELD評分、PBMC CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平是失代償期肝硬化患者發(fā)生SBP的獨立危險因素,PBMC CD36/mTORC1信號通路水平上調(diào),其意義需要進一步研究。