劉地，楊闊，杜倩潔，周慧琴，鄧佳，，伍健榕，王芳，3

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224)

油茶(Camelliaoleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬小型常綠喬木或灌木，是我國特有的木本油料植物[1]。油茶炭疽病是油茶的主要病害，重病區(qū)產(chǎn)量可縮減40%～80%[2]。根據(jù)研究報道，油茶炭疽病的病原菌有8種，如油茶果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和暹羅炭疽菌(C.siamense)等，其病原菌在油茶整個生育期均可侵染[3-4]。目前，對于油茶炭疽病的主要防治措施是化學(xué)防治[5]。使用化學(xué)農(nóng)藥防治油茶炭疽病，雖然能高效降低油茶損失，但由于炭疽病病原菌具有較強的適應(yīng)能力，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會對植物造成氧化脅迫使植物生長受抑[6]。因此，尋找安全無害的防治方法是研究的重要方向。目前，利用拮抗細(xì)菌控制病害的方法顯示出了巨大的應(yīng)用前景。國內(nèi)外已有報道證明，芽孢桿菌(Bacillustequilensis)具有廣譜抑菌性，抑菌機理較為復(fù)雜，通常是多種抑菌機制協(xié)同發(fā)揮作用[7-8]。芽孢桿菌防治病原菌的方式主要有：與病原菌進行營養(yǎng)競爭和生態(tài)位點競爭來防治病原菌；形成生物膜提高其生防效果[9]；產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[10-11]來造成細(xì)胞畸變，使原生質(zhì)發(fā)生凝集和外溢[11-12]；分泌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等裂解酶來抑制病原菌菌絲生長；通過破壞細(xì)胞膜完整性和誘導(dǎo)孢子中活性氧的積累來抑制病原菌的生長[13-15]。此外，芽孢桿菌還可以通過促進植物生長并分泌次生代謝產(chǎn)物或誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)來防治植物病害[16]。如：徐睿等[3]發(fā)現(xiàn)以枯草芽孢桿菌YL 13發(fā)酵液對暹羅炭疽菌抑制效果可達到68.03%；曹娜等[17]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌發(fā)酵液具有較好的穩(wěn)定性，能使病原菌菌絲發(fā)生形態(tài)變化。

芽孢桿菌DZY 6715是一株內(nèi)生拮抗芽孢桿菌，對油茶炭疽病害有很好的生防效果[18]，但是其防治效果與化學(xué)殺菌劑相比仍有很大差距。褪黑激素(melatonin，MT)在植物體生理調(diào)節(jié)、增強植物抗逆性方面起著非常重要的作用[19-20]，可激活冷害[21]、干旱[22]和鹽脅迫等多種非生物脅迫下植物的抗氧化系統(tǒng)，通過提高植物防御酶活性和其相對基因表達量等來提高植物的抗逆性[21]。劉亞萍[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白菜(Brassicarapavar.glabra)灌施400 μmol/L的褪黑素溶液時，可有效降低根腫病的病情指數(shù)和發(fā)病率。目前，關(guān)于MT誘導(dǎo)的植物抗病內(nèi)容較為豐富，但當(dāng)MT作為一種誘導(dǎo)因子直接作用于拮抗細(xì)菌進而提高其生防效力的研究目前尚無報道。本研究以油茶為實驗材料，研究特基拉芽孢桿菌DZY 6715對暹羅炭疽菌的生防效果，以探究褪黑素誘導(dǎo)芽孢桿菌DZY 6715抗油茶炭疽病的抗病機理。該研究結(jié)果將為探尋提高DZY 6715生防效力的途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌

炭疽病原菌 暹羅炭疽菌(CS)。

生防菌 特基拉芽孢桿菌DZY 6715(BacillustequilensisDZY 6715)，由西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 油茶品種

2 a生的油茶幼苗(長林系列)，購買于江西吉安，現(xiàn)種植于西南林業(yè)大學(xué)。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.1.4 誘導(dǎo)物制備

褪黑素購于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。參考Jiang等[24]和何歡等[25]的方法配制不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)褪黑素溶液并避光保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度褪黑素對芽孢桿菌DZY 6715生長的影響

將預(yù)先培養(yǎng)并調(diào)整濃度為1×107CFU/mL的芽孢桿菌DZY 6715菌懸液(按1%接種量)加入至含有不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(28 ℃、140 r/min)，分別于12、24、48、72、96、120 h收集菌懸液并測定OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌液OD600為縱坐標(biāo)繪制其生長曲線。

1.2.2 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑菌活性測定

平板對峙方法參照周璦婷[19]。處理組為不同誘導(dǎo)時間(24、48、72、96、120 h)和誘導(dǎo)物MT不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)，對照組為水。在7 d時測量對照組病原菌菌落半徑(R1)和對峙組病原菌菌落中心到DZY 6715菌落邊緣的距離(R2)，并計算對病原菌菌絲的生長抑制率(R抑)。每個處理3個重復(fù)，公式如下。

1.2.3 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715生物膜成膜能力測定

使用結(jié)晶紫染色法，取單菌落接種到不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于72 h取樣1 mL加入至24孔板中，后加入等體積的LB液體培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h進行0.1%結(jié)晶紫染色，40%冰醋酸溶解，并在紫外分光光度計下測定在560 nm處的吸光值。每個處理3個重復(fù)。

1.2.4 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性測定

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的 LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于24、48、72、96、120 h收集菌懸液，測定幾丁質(zhì)酶(chitinase)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，β-1,3-GA)活性，每處理3個重復(fù)。操作步驟按照試劑盒說明書進行(試劑盒購買于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。幾丁質(zhì)酶酶活表示方法為每毫升培養(yǎng)液每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位〔mg/(h·mL)〕，β-1,3葡聚糖酶酶活表示方法為每1 mL血清(漿)每小時產(chǎn)生1 mg還原糖定義為一個酶活性單位〔mg/(h·mL)〕。

1.2.5 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽病原菌菌絲破壞作用

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于72 h收集菌懸液，加入CS病原菌菌絲，制成混合液，以無菌培養(yǎng)液為對照，每處理3個重復(fù)。28 ℃、180 rpm/min培養(yǎng)后，分別于24、48、72、96、120 h取樣，測定電導(dǎo)率，10 000 rpm、4 ℃離心10 min后測定OD260，丙二醛含量(nmoL/g)和可溶性蛋白含量(mg/mL)測算按照試劑盒說明書進行(試劑盒購買于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。

1.2.6 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病的抑制作用

選取健康且大小一致的2 a生‘長林系列’油茶葉片作為接種對象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無菌水將葉片清洗3次后晾干；浸泡到MT誘導(dǎo)后的菌懸液(0、50、100、200、400 μmol/L)和不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)溶液中，每個處理9個重復(fù)。放置2 h后，使用一次性注射器將葉片葉脈兩側(cè)挑破，接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每天觀察發(fā)病情況并測定病斑面積。

1.2.7 不同誘導(dǎo)時間下芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病抗病性的影響

葉片處理方法同1.2.6。葉片用菌懸液(50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h)浸泡處理，分別于放置2、6、12、18、24、30 h后接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，每天觀察發(fā)病情況并測定病斑面積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法和t檢驗進行差異顯著性檢驗(α=0.05)。采用Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖形制作，Photoshop 軟件進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對芽孢桿菌DZY 6715生長的影響

芽孢桿菌DZY 6715的OD600隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，即其細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高并于72 h進入穩(wěn)定期(圖1)。進入穩(wěn)定期后，50 μmol/L MT誘導(dǎo)下DZY 6715的細(xì)胞濃度顯著高于其他濃度褪黑素誘導(dǎo)下的細(xì)胞濃度，且在50 μmol/L MT誘導(dǎo)下DZY 6715的細(xì)胞濃度在72、96、120 h分別是未誘導(dǎo)的1.57、1.17和1.52倍，表明50 μmol/L MT誘導(dǎo)處理顯著提高了芽孢桿菌DZY 6715的細(xì)胞濃度。

圖1 不同濃度MT處理的芽孢桿菌DZY 6715 的OD600

2.2 不同誘導(dǎo)時間和褪黑素濃度下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑菌活性

MT誘導(dǎo)的芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌的抑制效果顯著高于未誘導(dǎo)菌株(表1)，各處理抑菌率均高于50.00%。抑菌率隨著誘導(dǎo)時間的延長呈先上升后下降趨勢，其中褪黑素在50 μmol/L水平時，在不同誘導(dǎo)時間(24、48、72、96、120 h)下的抑菌率顯著高于其他處理組，且不同濃度MT(50、100、200、400 μmol/L)在誘導(dǎo)72 h時抑菌率最高，分別為76.33%、72.33%、71.67%和68.67%。

表1 不同濃度MT和誘導(dǎo)時間下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑制率Tab.1 Inhibition rate of Bacillus tequilensis DZY 6715 on anthracnose mycelium under different concentrations of MT and different induction time

由圖2可以看出，不同濃度MT誘導(dǎo)DZY 6715處理對炭疽菌菌絲并無明顯影響，但在MT誘導(dǎo)72 h之后，可以明顯看出芽孢桿菌DZY 6715在營養(yǎng)體上擴散面積最廣，這可能是其抑制率增強的原因。

圖2 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)DZY 6715處理對炭疽菌菌絲生長的影響Fig.2 Effects of B.tequilensis DZY 6715 treatment induced by different melatonin concentrations on hyphal growth of anthrax

2.3 不同誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY6715生物膜成膜能力

由圖3可以看出，MT處理下的生物膜與未處理的均存在差異，所有處理培養(yǎng)時間與生物膜成負(fù)相關(guān)關(guān)系，培養(yǎng)時間越久生物膜形成能力越弱。未誘導(dǎo)菌株在24～48 h生物膜產(chǎn)量逐漸上升，72～96 h產(chǎn)量下降，且在靜置培養(yǎng)96 h時，生物膜出現(xiàn)解離、浮游的狀態(tài)。經(jīng)MT誘導(dǎo)后的DZY 6715，其生物膜的產(chǎn)量明顯提高且與未誘導(dǎo)菌株的變化趨勢大致相同，但在96 h時未觀察到解離狀態(tài)；MT處理后在靜置培養(yǎng)12～24 h、24～96 h分別處于最初的黏附、成膜的穩(wěn)定的階段。50 μmol/L MT處理的DZY 6715各時間段內(nèi)生物膜產(chǎn)量均有上升，顯著優(yōu)于對照組，表明經(jīng)50 μmol/L MT處理后的DZY 6715具有較強的生物膜形成能力，其菌懸液在靜置培養(yǎng)24 h時OD560達到最大值，生物膜厚度明顯變厚，褶皺變多，顯著高于其他MT濃度處理組，這可能有助于其在植物表面定殖。

圖3 不同MT處理對DZY 6715生物膜OD值的影響

2.4 50 μmol/L褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性

由圖4可知，經(jīng)MT誘導(dǎo)過后的菌液內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性在不同時間段內(nèi)均顯著升高。不同誘導(dǎo)時間下50 μmol/L濃度菌液幾丁質(zhì)酶活性分別為2.13、2.23、2.19、2.27、2.30 U/mL。表明MT誘導(dǎo)處理可使菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性升高，從而達到抑菌目的。菌液的β-1,3-葡聚糖酶活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，且MT處理組的該酶活性均較對照組顯著升高。在72 h、 50 μmol/L濃度處理組的β-1,3-葡聚糖酶活性達到峰值4.5 U/mL，較對照組的酶活性3.46 U/mL顯著升高了31%。表明經(jīng)MT誘導(dǎo)處理后的發(fā)酵液β-1,3-葡聚糖酶活性顯著升高，能使細(xì)胞壁降解，抑制菌絲生長。

圖4 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌菌液胞外水解酶活性

2.5 芽孢桿菌DZY 6715對炭疽病原菌菌絲的破壞作用

如圖5所示，對照組MDA濃度在120 h時間段內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，處理間無顯著變化；與對照組相比，相同時間50 μmol/L MT處理組菌絲體MDA濃度顯著上升(P<0.05)，均高于對照組和未誘導(dǎo)菌株，且MT處理組MDA濃度維持在較高水平，基本呈現(xiàn)拮抗越久，菌絲體MDA含量越高。

圖5 MT誘導(dǎo)芽孢桿菌對炭疽菌的破壞作用

對照組菌體培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量極低；經(jīng)MT誘導(dǎo)下的DZY 6715發(fā)酵液作用后，蛋白質(zhì)含量迅速增加，后趨于穩(wěn)定。在培養(yǎng)48 h時間段，50 μmol/L MT處理發(fā)酵液是對照組的13.5倍，對比未誘導(dǎo)菌株上升61.6%。推測MT誘導(dǎo)后的發(fā)酵液可能破壞了炭疽菌菌體細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量增加。

當(dāng)微生物細(xì)胞膜遭到較大破壞時，核酸等大分子物質(zhì)也會釋放到細(xì)胞外。核酸在波長260 nm處有很強的紫外吸收，測定細(xì)胞外OD260有助于判斷菌體細(xì)胞膜破壞程度。如圖5所示，OD值是隨著時間而升高，MT誘導(dǎo)處理與未誘導(dǎo)菌株菌液趨勢一致，但50 μmol/L MT處理發(fā)酵液OD值對比未誘導(dǎo)菌株菌液存在顯著差異，在120 h時間段中達到峰值28.43 ug/uL，說明MT誘導(dǎo)處理的DZY 6715增強炭疽菌核酸泄露。

在整個時段內(nèi)，MT處理和CK的菌絲相對電導(dǎo)率總體上都呈現(xiàn)一個上升的趨勢，且MT處理較對照組顯著增加，在培養(yǎng)72 h時達到最大值88.09%，是對照組的1.12倍。說明與CK相比，MT處理下的炭疽菌絲的損傷程度增大，通透性增加，加速菌體細(xì)胞質(zhì)滲漏到細(xì)胞外。

2.6 不同濃度MT誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對炭疽菌的抑制作用

如圖6、7所示，在不同濃度MT誘導(dǎo)下，72 h的芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對炭疽病病原菌都有一定的抑制作用，且MT誘導(dǎo)DZY 6715處理病斑面積均小于對照組和純培養(yǎng)，呈現(xiàn)病斑面積隨MT濃度增加而增大的趨勢。其中50 μmol/L MT處理發(fā)酵液有較好的抗病效果，病斑面積顯著縮小，是對照組的15.3%，純培養(yǎng)的28.4%。而不同濃度MT溶液對病斑面積并無明顯影響，基本呈現(xiàn)病斑面積隨MT濃度增加而減小的趨勢，說明單獨使用MT對油茶的病斑大小無顯著影響。

圖6 不同MT處理芽孢桿菌DZY6715對油茶葉片炭疽病的控制效果

圖7 不同MT處理芽孢桿菌DZY 6715和單獨MT對炭疽病的控制效果

2.7 發(fā)酵液處理葉片時間對炭疽病的控制效果

由圖8可以看出，對比對照組來說，MT處理均對葉片病斑面積的擴增有明顯的抑制效果，其中，第2 h和24 h處理組效果比較明顯，較對照組縮小84.1%和88.46%。

圖8 發(fā)酵液處理葉片時間對炭疽病的控制效果Fig.8 Control effect of leaf time on anthracnose

3 討論與結(jié)論

已有研究證明，天然高分子化合物可有效提高生物防治效果，化合物作為激發(fā)子誘導(dǎo)培養(yǎng)可顯著提高生防菌的拮抗效力[26]，促進生防菌生長繁殖和菌株活力等。本研究結(jié)果表明低濃度MT(50 μmol/L)誘導(dǎo)DZY 6715菌懸液細(xì)胞數(shù)量增加，且顯著高于未誘導(dǎo)菌株，細(xì)胞濃度在72 h時達到峰值，說明MT作為生物激發(fā)子在低濃度條件下對菌株DZY 6715有一定促進生長作用，使細(xì)胞活力增強，種群密度上升。隨著MT濃度的逐漸升高，其對芽孢桿菌DZY 6715的促進生長作用逐漸降低，且隨著濃度的進一步升高會呈現(xiàn)抑制作用，與此結(jié)果類似，有研究報道當(dāng)濃度高于1 000 μmol/L會顯著抑制芽孢桿菌的等的生長[27]。推測MT對芽孢桿菌生長的影響可能遵循報酬遞減規(guī)律，這與Yu等的結(jié)果相似[28]。而當(dāng)拮抗菌株達到一定的種群密度，就可能會產(chǎn)生群體效應(yīng)由單細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬ば螒B(tài)[29]，幫助菌體更好地附著于植物表面，在激活植物防御反應(yīng)、拮抗病原微生物等方面幫助植物抵御病害侵染。生物膜的形成可能是拮抗菌防治病害的新機理之一。MT誘導(dǎo)可以增強DZY 6715的生物膜形成能力，進而提升其對油茶炭疽菌的抑制作用。本研究結(jié)果表明，50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715在平皿對峙試驗中對炭疽菌的抑制率可達到76.33%，顯著高于未誘導(dǎo)菌株。同時50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h 的DZY 6715在葉片上也能控制炭疽病病斑的擴展，這可能是50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715細(xì)胞活力最強，能迅速占領(lǐng)空間，從而有效地與病原菌形成營養(yǎng)與空間上的競爭，抑制炭疽病菌的入侵和繁殖。此外，誘導(dǎo)菌株對油茶葉片的處理時間也顯著影響其對炭疽病原菌的控制，處理24 h時病斑面積最小，這可能是由于50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h 的DZY 6715菌株生物膜形成能力在24 h時最強，且在葉片上處理24 h后，對病原菌產(chǎn)生了系統(tǒng)抗病性。這與何方濤[30]的研究結(jié)果類似，誘導(dǎo)激發(fā)培養(yǎng)后提高了拮抗菌對病原菌的控制效力，生防菌在抑菌過程中分泌一些物質(zhì)如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶，可破壞真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁。林福呈等[31]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以進入真菌細(xì)胞壁繁殖并分泌溶菌物質(zhì)。本研究中MT誘導(dǎo)可以增強DZY 6715幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶活性，破壞真菌細(xì)胞壁。細(xì)胞膜是真菌組織結(jié)構(gòu)的一部分，能夠維持正常的生理結(jié)構(gòu)，有效調(diào)節(jié)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保障其正常生命活動[32]。已有研究表明，許多芽孢桿菌可以分泌次級代謝產(chǎn)物如surfactin、fengycin和difficidin等抗菌物質(zhì)，這些物質(zhì)可以破壞真菌細(xì)胞壁，通過改變真菌細(xì)胞膜的通透性來破壞其內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而起到抑菌作用。病原菌細(xì)胞膜受損，其內(nèi)含物外滲，培養(yǎng)液電導(dǎo)率增加。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，能夠衡量菌絲體的膜脂過氧化水平[32]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)戊二醛處理使病原菌細(xì)胞內(nèi)積累大量活性氧，且MDA含量劇增，表明菌絲體發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，膜系統(tǒng)受損。而細(xì)胞膜被破壞，通透性增加，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白和核酸，菌體蛋白質(zhì)和核酸外泄會嚴(yán)重影響正常的生命活動[34]。Wang[35]等研究也發(fā)現(xiàn)，在灰霉菌細(xì)胞膜被破壞后，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白和核酸釋放。本研究中，經(jīng)50 μmol/L MT誘導(dǎo)DZY 6715處理的病原菌菌絲，其電導(dǎo)率和MDA顯著高于未誘導(dǎo)菌株，OD260和可溶性蛋白的含量增加，說明MT誘導(dǎo)DZY 6715增強其對炭疽菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使病細(xì)胞膜的通透性增加，釋放細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白。綜上，MT誘導(dǎo)芽孢桿菌DZY 6715可以通過分泌相關(guān)活性酶如幾丁質(zhì)、葡聚糖酶，破壞病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體內(nèi)含物外泄，進而達到溶菌目的。

實驗發(fā)現(xiàn)，MT處理和未誘導(dǎo)菌株的DZY 6715菌懸液對油茶葉片的抗炭疽病效果也有不同，其中50 μmol/L MT平板對峙抑菌率為76.33%，表明誘導(dǎo)后的菌株與病原菌對峙培養(yǎng)后，能迅速占領(lǐng)空間，從而有效地與病原菌形成營養(yǎng)與空間上的競爭[35-36]。葉片離體實驗表明，MT誘導(dǎo)后的芽孢桿菌DZY 6715處理油茶葉片，其病斑面積縮減，50 μmol/L MT處理表現(xiàn)最佳，這與何方濤[30]的研究結(jié)果類似，誘導(dǎo)培養(yǎng)后提高了拮抗菌對病原菌的控制效力。由50 μmol/L MT誘導(dǎo)的DZY 6715處理后，再放置不同時間后接種病原菌于葉片，均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生抗病性，從而增強植株自身防御反應(yīng)，且以放置24 h后病斑面積最小。這可能是因為DZY 6715菌株的生物膜形成能力在24 h時最強，可以在油茶葉片上進行定殖，從而提高拮抗能力，而單獨施用MT對油茶葉片抗病并無明顯作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明低濃度的MT誘導(dǎo)可以促進芽孢桿菌DZY 6715生長，且50 μmol/L MT誘導(dǎo)后的菌株生防效果最好；MT作為誘導(dǎo)激發(fā)子低濃度時可以增強芽孢桿菌DZY 6715對暹羅炭疽菌的抑制效果，且50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715菌株效果最好；誘導(dǎo)的DZY 6715菌株具有較強的生物膜形成能力，分泌幾丁質(zhì)和葡聚糖酶，破壞了病原菌菌絲的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而使病原菌溶解死亡。本研究結(jié)果可為油茶高效生防菌劑開發(fā)利用提供理論參考，使其大規(guī)模應(yīng)用并替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑成為可能。然而，雖然明確了MT作為誘導(dǎo)激發(fā)子可以增強芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病病菌的抑制作用，但其抑菌機制和抗病機理尚不明確。后續(xù)宜對植物微觀結(jié)構(gòu)、生理生化及轉(zhuǎn)錄水平進一步深入研究。